Mycket känslig analys för Mätning av Arenavirus-cellvidhäftning
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenavirus är en familj av hölje, enkelsträngade RNA-virus som i första hand hålls i gnagare i naturen 1-3. Även om dessa virus etablera typiskt en asymtomatisk, ihållande infektion i gnagare reservoarer 1,2, kan de orsaka svår sjukdom hos människor 3. Viktiga patogena arter är den nya världen Junin virus (JUNV) 4 och den gamla världen Lassa-virus 5, som är det etiologiska agenter argentinska hemorragisk feber i Sydamerika och Lassafeber i Afrika, respektive. Lymfocytiskt koriomeningitvirus (LCMV), den prototypiska virus av familjen 6, har en global distribution och är ansvarig för en rad olika sjukdomstillstånd, inklusive aseptisk meningit hos immunkompetenta personer 6, allvarliga fosterskador i det växande fostret 7, eller hög dödlighet hos immunosupprimerade individer efter fast organtransplantation 8,9. Bristen i Förenta StaternaFood and Drug Administration (FDA) -godkända vacciner eller effektiva antivirala läkemedel för att bekämpa dessa virus belyser den kritiska behovet av att utveckla nya strategier för att terapeutiskt rikta dessa nya / återkommande patogener.
Den arenavirus genomet består av två enkelsträngade RNA-segment, den stora (L) (~ 7,2 kb) och små (S) (~ 3,6 kb) segment 10. S-segmentet kodar det virala nukleoprotein (NP) och höljesglykoprotein (GP), medan L-segment kodar det virala polymeraset (L) och matrisprotein (Z). L och S iska RNA-segment (vRNAs) förpackas i virioner 10-12. Det första steget i arenavirus infektion är fästandet av viruspartiklar till värdceller genom en interaktion mellan den virala GP och dess motsvarande värdcellreceptorer som, för JUNV, innefattar den humana transferrinreceptorn 1 (hTfR1) 13,14. Efter bindning är JUNV partiklar tas in i cellen via clathrin-medierad endocytos 15.Partiklar trafik till den sena endosomen där den låga pH-värdet i denna avdelning utlöser aktiveringen av GP 16,17. När den är aktiverad, GP-kodade fusionspeptid skär i det endosomala membranet, initiera fusion mellan de virala och endosomala membran. Framgångsrika fusionsresulterar i frisättning av virionet förpackade vRNAs in i cytoplasman, där de tjänar som schabloner för genomisk replikation och transkription. När genereras tillräckliga mängder av virusstrukturproteiner och vRNAs, nya partiklar montera och knopp från den infekterade cellen att slutföra livscykel 18.
För att underlätta upptäckten av nya strategier för att terapeutiskt rikta patogena arenavirus, har vår grupp fokuserat på identifiering av värdfaktorer som är kritiska för virus förökning, men umbärliga för värden. I detta sammanhang är det nödvändigt att fastställa den exakta skedet (n) och den virala livscykeln som kontrolleras av sådana värdfaktorer för att styrautveckling av antivirala strategier. Häri beskriver vi en kvantitativ (q) RT-PCR-baserad analys som kan användas för att mäta arenavirus-cellbindning i syfte att identifiera huruvida utvalda värdproteiner och / eller antivirala molekyler påverka detta inledande skede av viralt inträde 19. Alternativa metoder för att mäta arenavirus-cellbindning har presenterat virioner märkta med biotin 20, fluorescerande färgämnen 21 eller radioaktiva isotoper 22. Nackdelar med dessa metoder kan innefatta krav på stora mängder av ingångs virus (t.ex. höga multipliciteter av infektion (MOI)), användning av radioaktivitet, och / eller ytterligare hanteringssteg för att förbereda ingångs virus (t.ex. koncentration och / eller märkning av virus) . I synnerhet användningen av höga MOI gör det svårt att skilja produktiv kontra icke-produktiva fäst händelser 15,23. Den QRT-PCR-baserad analys som beskrivs här kan upptäcka fäst händelser med hjälp av så få som 20 plack förming-enheter (PFU) av virus, vilket leder till en MOI av 0,0004 för en 48-brunnar. Därför är den starka känsligheten för analysen övervinner kravet på högt MOI samt eventuella virus märkning eller koncentrationssteg. Vidare kan analysen vara i) anordnade att mäta virion endocytos såväl som frisättning av virusgenomet in i cytoplasman efter fusion och ii) anpassad för användning med andra virus genom utveckling av virusspecifika QRT-PCR-reagens (för exempel, se 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet vi beskriver är enkel och robust under förutsättning att följande kritiska överväganden observeras. Först måste strikt pre-PCR-teknik användas (se 28 för en utmärkt översyn). Det är absolut nödvändigt att alla reagenser och utrustning är fria från förstärkt DNA innehållande qPCR målsekvensen och att lämpliga kontroller för att upptäcka sådan förorening. För det andra, för viruscellfäst delen av protokollet, virus, celler och media måste hållas vid 4 ° C för att fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, och Benjamin kung för hjälpsamma diskussioner och National Institutes of Health för stöd av dessa studier genom bidrag T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), och P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
