Получение Крыса олигодендроцитов предшественники культур и Количественная оценка Oligodendrogenesis Использование двойного инфракрасного флуоресцентного Сканирование
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Эффективное нервной проводимости в центральной нервной системе млекопитающих (ЦНС) требует миелинизации аксонов путем олигодендроцитов. Во время разработки, олигодендроциты возникает из совокупности клеток олигодендроцитов предшественников (OPCS), которые считаются мигрировать из желудочковой зоны развивающегося переднего мозга и нервной трубки 1. После миграции OPCs дифференцироваться в зрелые, myelinating олигодендроцитов, что не только способствует эффективному распространению импульса, но и обеспечить аксоны с трофической поддержки 2. Взрослых ЦНС содержит обильные население OPCs, что разбросаны по всему серого и белого вещества, содержащего примерно 5-8% всех клеток 3. После демиелинизирующих оскорбление, OPCs мигрируют к месту повреждения, размножаются, и дифференцируются, чтобы заменить утраченные или поврежденные миелиновые оболочки на открытых аксонов. Тем не менее, в некоторых ситуациях болезнь / травмы, этот процесс оказывается неэффективным или может не полностью 4. В то время какхронический демиелинизация думали, чтобы добавить к бремени болезней, эффективного oligodendrogenesis и ремиелинизации может облегчить симптомы 5. Поэтому было интересно изучить OPCs в пробирке, чтобы определить влияние экспериментальных факторов на oligodendrogenesis.
Понимание различных этапах олигодендроцитов дифференциации стало возможным путем идентификации стадии конкретных клеточных маркеров. Самообновляющихся ранние клетки-предшественники определяются их экспрессии, полученный из тромбоцитов альфа рецептора фактора роста (PDGFRα), нейронная / глии антиген 2 (NG2) и A2B5 6 – 8. Как OPCs инициировать их дифференциации программы и вывести из клеточного цикла, они подавляют экспрессию этих маркеров и начинают экспрессировать белки, свидетельствующие о premyelinating олигодендроциты включая циклические нуклеотидов 3'-фосфодиэстеразы (CNPase) и O4. Наконец, их дифференциация в более зрелом oligodendrocytes характеризуется экспрессией миелиновых белков, ассоциированных, в том числе миелиновой-ассоциированный гликопротеин (MAG), протеолипидного белка (PLP), и основного белка миелина (ОБМ). МВР является внутриклеточным периферической мембранным белком и является основным компонентом миелиновой оболочки. Мыши, лишенные MBP разработать тяжелый фенотип, в которых ЦНС миелинизации значительно снижается, ведущий к тремор, судороги и ранней смерти 9,10. Это важная роль MBP в миелинизации привело к его использованию в качестве маркера олигодендроцитов дифференциации в пробирке и в естественных условиях 11.
Количественное определение MBP может быть достигнуто с использованием нескольких различных методик. ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга позволяют количественно оценить уровни ОБМ при различных схемах лечения. Иммуноцитохимическая является общей качественный подход, который также может быть количественным, когда используются подходы микроскопии камеры на основе. Хотя эти системы являются надежными и фундаментальное значение дляизучение олигодендроцитов дифференциации, каждый из них имеет свои собственные недостатки, которые ограничивают их использование в скрининге лекарственных. Во-первых, количество первичных OPCs, которые необходимы для ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализа снижает количество переменных, которые могут быть рассмотрены одновременно. В то время как требование ячейка для иммуноцитохимию значительно ниже, существенное время должно быть посвящено каждого эксперимента, если количественное и есть цель. Многочисленные изображения должны быть захвачены, а затем количественно для облегчения анализа экспериментальных. Эти оговорки стали важными препятствиями, которые следует учитывать для исследований, которые требуют высокую оценку пропускную способность. Здесь мы описываем способ, который использует основные аспекты от обоих иммуноцитохимию и западных методик блоттинга для миелина количественного, при этом значительно снижая как количество клеток, необходимых и времени, чтобы завершить количественный анализ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные здесь описывает быстрый и надежный метод для выделения OPCs крыс и количественной экстракорпоральное oligodendrogenesis в ответ на экспериментальных факторов. Используя положительный выбор, высокие урожаи жизнеспособных и чистых OPCs используются непосредственно ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Грант спонсора: Национальные институты здравоохранения; Количество Грант: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
