Préparation de cultures Rat oligodendrocytes progénitrices et la quantification des oligodendrogenèse par analyse de fluorescence à double infrarouge
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Efficace conduction nerveuse dans le système nerveux central des mammifères (CNS) exige la myélinisation des axones par les oligodendrocytes. Au cours du développement, les oligodendrocytes proviennent d'un pool de cellules progénitrices oligodendrocytes (OPC) qui sont pensés pour migrer des zones ventriculaires du cerveau antérieur développement et tube neural 1. Après OPC de migration se différencient en oligodendrocytes matures, myélinisantes que non seulement faciliter la propagation de l'influx efficace, mais aussi de fournir des axones avec le soutien trophique 2. Le SNC adulte conserve une population abondante d'OPC qui sont dispersées dans toute la substance grise et blanche comprenant environ 5-8% de toutes les cellules 3. Suite à une insulte démyélinisante, OPC migrent vers le site de la lésion, prolifèrent, et se différencient pour remplacer les gaines de myéline perdus ou endommagés sur axones exposés. Cependant, dans certains contextes maladie / blessure, ce processus est jugée inefficace ou peut échouer complètement 4. Tandis quedémyélinisation chronique est pensé pour ajouter à la charge de morbidité, oligodendrogenèse et la remyélinisation efficace peut atténuer les symptômes 5. Il a donc été intéressant d'étudier les OPC in vitro pour déterminer l'effet de facteurs expérimentaux sur oligodendrogenèse.
Aperçu des différentes phases de différenciation des oligodendrocytes a été rendue possible par l'identification de marqueurs cellulaires spécifiques de la scène. Auto-renouvellement des cellules souches précoces sont définis par leur expression dérivé des plaquettes récepteur du facteur de croissance alpha (PDGFRa), l'antigène de neurones / cellules gliales 2 (NG2) et A2B5 6-8. Comme OPC lancer leur programme de différenciation et se retirent du cycle cellulaire, ils régulent à la baisse l'expression de ces marqueurs et commencent à exprimer des protéines indiquant premyelinating oligodendrocytes dont Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) et O4. Enfin, leur différenciation en oligodendroc plus matureytes est caractérisé par l'expression de protéines associées à la myéline, y compris la glycoprotéine associée à la myéline (MAG), la protéine protéolipidique (PLP), et la protéine basique de la myéline (MBP). MBP est une protéine de membrane périphérique intracellulaire et une composante majeure de la gaine de myéline. Les souris dépourvues MBP développent un phénotype sévère dans laquelle myélinisation du SNC est diminué de façon significative conduit à des tremblements, des convulsions et la mort précoce 9,10. Ce rôle important dans la myélinisation de MBP a conduit à son utilisation en tant que marqueur de la différenciation des oligodendrocytes in vitro et in vivo 11.
La quantification de la MBP peut être réalisée en utilisant plusieurs méthodes différentes. RT-PCR et l'analyse par transfert de Western pour permettre la quantification des niveaux MBP sous différents régimes de traitement. Immunocytochimie est une approche qualitative commune qui peut aussi être quantitative lorsque des approches de microscopie par caméra sont utilisés. Bien que ces systèmes sont fiables et fondamentale pourl'étude de la différenciation des oligodendrocytes, ils ont chacun leurs propres inconvénients qui limitent leur utilisation dans le criblage de médicaments. En premier lieu, la quantité d'OPC de base qui sont nécessaires pour la RT-PCR et l'analyse par Western blot de réduire le nombre de variables qui peuvent être examinées simultanément. Bien que l'exigence de la cellule pour immunocytochimie est beaucoup plus faible, beaucoup de temps doit être consacré à chaque expérience, si la quantification est le but. De nombreuses images doivent être capturés et ensuite quantifiés pour faciliter l'analyse expérimentale. Ces mises en garde deviennent des obstacles importants à considérer pour les études qui nécessitent une évaluation à haut débit. Nous décrivons ici un procédé qui utilise les aspects fondamentaux à la fois du immunocytochimie et les méthodes de Western blot pour la quantification de la myéline, tout en réduisant considérablement le nombre de cellules nécessaires et de temps pour terminer l'analyse quantitative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici décrit une méthode rapide et fiable pour isoler les OPC de rat et de quantifier en oligodendrogenèse vitro en réponse à des facteurs expérimentaux. Utilisation de la sélection positive, les rendements élevés de OPC viables et purs sont utilisés directement à des fins expérimentales. Cette méthode simplifie l'isolement, la culture, et les étapes de différenciation dans un délai de 1 semaine, et les cellules fixes peut être facilement stocké à 4 ° C pen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant commanditaire: National Institutes of Health; Numéro de subvention: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
