デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
哺乳動物の中枢神経系（CNS）における効率的な神経伝導がオリゴデンドロサイトによって軸索の髄鞘形成を必要とします。開発中に、オリゴデンドロサイトは、開発前脳と神経管1の心室ゾーンから移行すると考えられているオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）のプールから生じます。移行後のOPCは、効率的なインパルスの伝播を促進するだけでなく、栄養サポート2と軸索を提供するだけでなく、オリゴデンドロサイトをミエリン形成、成熟へと分化します。成体CNSは、すべてのセル3の約百分の5から8までを含む、グレーと白質全体に分散されているOPCの豊富な人口を維持します。脱髄傷害後、OPCが、損傷部位に遊走増殖し、露出した軸索上の紛失または破損したミエリン鞘を置き換えるために分化します。しかし、いくつかの疾患/損傷の設定では、このプロセスは非効率的であることが見出されたまたは完全に4失敗することができます。同時に慢性脱髄は、症状5を軽減することができる疾患、効率的oligodendrogenesisおよび再ミエリン化の負担に追加すると考えられています。したがって、oligodendrogenesisに関する実験要因の影響を決定するために、in vitroでのOPCを研究するために注目されています。
乏突起膠細胞の分化の異なる段階への洞察は、ステージ特異的な細胞マーカーを同定することによって可能となりました。 8 –自己再生初期前駆細胞は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRα）、神経/グリア抗原2（NG2）とA2B5 6の発現によって定義されます。 OPCには、それらの分化プログラムを開始し、細胞周期から撤退したように、彼らは、これらのマーカーの発現をダウンレギュレートし、環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ（CNPアーゼ）とO4を含むオリゴデンドロサイトをpremyelinatingを示すタンパク質を発現し始めます。最後に、より成熟したoligodendrocへの分化ytesは、ミエリン関連糖タンパク質（MAG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）などのミエリン関連タンパク質の発現によって特徴付けられます。 MBPは、細胞内の末梢膜タンパク質およびミエリン鞘の主要な成分です。 MBP欠損したマウスは、CNSミエリン形成が大幅に震え、痙攣、早期死亡9,10につながる減少している深刻な表現型を開発。髄鞘形成におけるMBPのこの重要な役割は、in vitroおよびin vivo 11 の両方のオリゴデンドロサイト分化のマーカーとしての使用につながっています。
MBPの定量化は、いくつかの異なる方法を用いて達成することができます。 RT-PCRおよびウェスタンブロット分析は、異なる治療計画の下MBPレベルの定量化を可能にします。免疫細胞化学は、カメラベースの顕微鏡手法が使用される場合にも、定量的であることができる共通の定性的なアプローチです。これらのシステムは、信頼性との基本であるが、オリゴデンドロサイト分化の研究では、それぞれが薬物スクリーニングにおけるそれらの使用を制限し、自分の欠点を有しています。まず、RT-PCRおよびウェスタンブロット分析のために必要とされる主要なOPCの量を同時に検査することができる変数の数を減少させます。免疫細胞化学のための細胞要件がはるかに低いですが定量化が目標である場合には、かなりの時間が各実験に専念しなければなりません。多数の画像が取り込まれ、その後、実験的な分析を容易にするために、定量化する必要があります。これらの注意事項は、高スループットの評価を必要とする研究のために考慮すべき重要な障害となります。ここでは、大幅に必要な細胞の数および定量分析が完了するまでの時間の両方を削減しながら、免疫細胞化学およびミエリン定量化のためのウェスタンブロット方法論の両方から基本的な側面を利用する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、ラットのOPCを単離し、実験的な要因に応じて、 試験管 oligodendrogenesis に定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を記載しています。正の選択を使用して、実行可能な、純粋なOPCの高い収率を実験目的のために直接使用されています。この方法は、1週間の時間枠に分離、培養、および分化工程を合理化し、固定された細胞は、好都合には、アッ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
グラントスポンサー：国立衛生研究所。グラント番号：R37 NS041435。
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
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