Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Efficient Nervenleitung in der Säugetiere Zentralnervensystem (ZNS) erfordert Myelinisierung von Axonen durch Oligodendrozyten. Während der Entwicklung entstehen Oligodendrozyten aus einem Pool von Oligodendrozyten-Progenitorzellen (OPC), die gedacht werden, von den ventrikulären Zonen der Entwicklung des Vorderhirns und Neuralrohr 1 zu migrieren. Nach der Migration OPCs zu reifen unterscheiden, myelinisierenden Oligodendrozyten, die nicht nur effizient Impulsausbreitung zu erleichtern, sondern auch Axone mit trophischen Unterstützung 2 liefern. Die adulten ZNS unterhält eine reichliche Population von OPCs, die während der grauen und weißen Substanz dispergiert sind, die ungefähr 5-8% aller Zellen 3. Nach einer demyelinisierenden Beleidigung, wandern OPCs zu der Stelle der Verletzung, vermehren und differenzieren verlorenen oder beschädigten Myelinscheiden an exponierten Axone zu ersetzen. Doch in einigen Krankheit / Verletzung Einstellungen wird dieses Verfahren ineffizient zu sein oder ganz ausfallen 4 gefunden. Währendchronische Demyelinisierung wird gedacht, um die Krankheitslast, effiziente oligodendrogenesis und Remyelinisierung kostenlos in fünf Symptome zu lindern. Es ist daher von Interesse gewesen OPCs in vitro zu studieren die Wirkung der experimentellen Faktoren auf oligodendrogenesis zu bestimmen.
Einblick in die verschiedenen Phasen der Oligodendrozyten-Differenzierung wurde durch die Identifizierung von Stufe spezifische Zellmarker ermöglicht worden. Selbst erneuernden frühen Vorläuferzellen durch ihre Expression von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRα), neuronalen / Glia-Antigen 2 (NG2) und A2B5 6 definiert sind – 8. Als OPC ihre Differenzierungsprogramm und ziehen sich aus dem Zellzyklus einleiten, herunterregulieren sie Expression dieser Marker und beginnen Proteine zu exprimieren bezeichnend für Oligodendrozyten mit zyklisch-Nukleotid-3'-Phosphodiesterase (CNPase) und O4 premyelinating. Schließlich deren Differenzierung in reiferen oligodendrocytes wird durch die Expression von Myelin-assoziierten Proteine, einschließlich Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), Proteolipidprotein (PLP) und basisches Myelinprotein (MBP) aus. MBP ist ein intrazelluläres peripheren Membranprotein und ein Hauptbestandteil der Myelinscheide. Mäuse entwickeln fehlt MBP einen schweren Phänotyp, in dem CNS Myelinisierung deutlich zu Zittern verringert führt, ist, Krämpfe und frühen Tod 9,10. Diese wichtige Rolle der MBP in Myelinisierung hat zu seiner Verwendung als ein Marker für Oligodendrozyten Differenzierung führte sowohl in vitro als auch in vivo 11.
Quantifizierung von MBP kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. RT-PCR und Western Blot-Analyse ermöglichen eine Quantifizierung der MBP-Niveaus unter verschiedenen Behandlungsschemata. Immunzytochemie ist eine gemeinsame qualitative Ansatz, der auch quantitativ sein können, wenn die Kamera-basierte Mikroskopie Ansätze verwendet werden. Obwohl diese Systeme sind zuverlässig und grundlegenddas Studium der Oligodendrozyten-Differenzierung, sie haben jeweils ihre eigenen Nachteile, die ihre Verwendung in Arzneimittel-Screening begrenzen. Erstens, die Menge der primären OPCs, die für RT-PCR und Western Blot-Analyse erforderlich sind, reduziert die Anzahl der Variablen, die gleichzeitig untersucht werden können. Während die Zelle Voraussetzung für Immunzytochemie viel niedriger ist, müssen erhebliche Zeit zu jedem Experiment gewidmet werden, wenn die Quantifizierung ist das Ziel. Zahlreiche Bilder müssen experimentelle Analyse zu erleichtern eingefangen und dann quantifiziert werden. Diese Einschränkungen werden wichtige Hindernisse für Studien zu berücksichtigen, die einen hohen Durchsatz Beurteilung erfordern. Hier beschreiben wir eine Methode, die grundlegenden Aspekte von nutzt sowohl der Immunzytochemie und Western Blot Methoden zur Quantifizierung Myelin, während erheblich sowohl die Anzahl von Zellen erforderlich ist und die Zeit zu reduzieren quantitative Analyse durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Isolierung von Ratten-OPCs und in vitro oligodendrogenesis in Reaktion auf experimentelle Faktoren zu quantifizieren. Mit positiven Selektion, hohe Ausbeuten an lebensfähig und rein OPCs werden direkt zu Versuchszwecken verwendet. Dieses Verfahren vereinfacht die Isolierung, Kultivierung und Differenzierung Schritte in 1-wöchige Zeitrahmen und fixierten Zellen können bequem bei 4 ° C über mehrere Wochen ohne Verlust a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gewähren Sponsor: National Institutes of Health; Förderkennzeichen: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
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