Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
conducción nerviosa eficiente en el sistema nervioso central de los mamíferos (CNS) requiere la mielinización de los axones por oligodendrocitos. Durante el desarrollo, surgen los oligodendrocitos a partir de un conjunto de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que se cree que la migración de las zonas ventriculares del cerebro anterior en desarrollo y el tubo neural 1. Después de los OPC de migración se diferencian en oligodendrocitos maduros, myelinating que no sólo facilitar la propagación del impulso eficiente, sino que también proporcionan los axones con soporte trófico 2. El sistema nervioso central adulto mantiene una abundante población de los OPC que están dispersos en toda la sustancia gris y blanco que comprende aproximadamente el 5-8% de todas las células 3. Luego de una lesión desmielinizante, los OPC migran al sitio de la lesión, proliferan y se diferencian para sustituir a las vainas de mielina perdidos o dañados en los axones expuestos. Sin embargo, en algunos lugares la enfermedad / lesión, este proceso se encuentra para ser ineficaz o puede fallar por completo 4. Mientrasdesmielinización crónica se cree que añadir a la carga de morbilidad, la remielinización oligodendrogenesis y eficiente puede aliviar los síntomas 5. Por ello, ha sido de interés para estudiar los OPC in vitro para determinar el efecto de los factores experimentales sobre oligodendrogenesis.
La comprensión de las diferentes fases de la diferenciación de oligodendrocitos ha sido posible gracias a la identificación de marcadores específicos de células de la etapa. Auto-renovación de células progenitoras tempranas se definen por su expresión de alfa derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento (PDGFR), el antígeno neuronal / glía 2 (NG2) y A2B5 6 – 8. Como OPCs inician su programa de diferenciación y se retiran del ciclo celular, que regulan negativamente la expresión de estos marcadores y comienzan a expresar proteínas indicativas de premielinizantes oligodendrocitos incluyendo cíclico de nucleótidos 3'-fosfodiesterasa (CNPase) y O4. Por último, su diferenciación en oligodendroc más maduroytes se caracteriza por la expresión de proteínas asociados a la mielina, incluyendo la glicoproteína asociada a la mielina (MAG), proteína proteolipídica (PLP), y la proteína básica de la mielina (MBP). MBP es una proteína de membrana periférica intracelular y un componente principal de la vaina de mielina. Los ratones que carecen MBP desarrollan un fenotipo grave en el que la mielinización del SNC está disminuida significativamente dando lugar a temblores, convulsiones y muerte temprana 9,10. Este importante papel de la MBP en la mielinización ha llevado a su uso como un marcador de la diferenciación de oligodendrocitos in vitro e in vivo 11.
La cuantificación de MBP se puede lograr usando varias metodologías diferentes. RT-PCR y análisis de transferencia Western permiten la cuantificación de los niveles de MBP bajo diferentes regímenes de tratamiento. La inmunocitoquímica es un enfoque cualitativo común que también puede ser cuantitativa cuando se usan enfoques de microscopía basados en cámaras. Aunque estos sistemas son fiables y fundamental parael estudio de la diferenciación de oligodendrocitos, cada uno de ellos tiene sus propias desventajas que limitan su uso en la detección de drogas. En primer lugar, la cantidad de OPCs principales que se necesitan para RT-PCR y análisis de transferencia Western reduce el número de variables que se pueden examinar simultáneamente. Mientras que el requisito para inmunocitoquímica de células es mucho más bajo, un tiempo considerable se debe dedicar a cada experimento si la cuantificación es la meta. Numerosas imágenes deben ser capturados y luego cuantificados para facilitar el análisis experimental. Estas advertencias se convierten en obstáculos importantes a tener en cuenta para los estudios que requieren una evaluación de alto rendimiento. Aquí se describe un método que utiliza aspectos fundamentales tanto de la inmunocitoquímica y metodologías de Western blot para la cuantificación de la mielina, mientras que reduce significativamente tanto el número de células requeridas y el tiempo para completar el análisis cuantitativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que se presenta aquí describe un método rápido y fiable para el aislamiento de los OPC de rata y cuantificar en oligodendrogenesis vitro en respuesta a factores experimentales. Usando la selección positiva, altos rendimientos de los OPC viables y puros se utilizan directamente para fines experimentales. Este método simplifica el aislamiento, cultivo y etapas de diferenciación en un marco de tiempo 1 semana, y las células fijadas se puede almacenar convenientemente a 4 ° C durante v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant patrocinador: Instituto Nacional de Salud; Grant número: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
