Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Memeli merkezi sinir sisteminde (MSS) etkili sinir iletim oligodendrositlerin akson myelinizasyonunu gerektirir. Gelişimi sırasında, oligodendrosit gelişmekte olan ön beyin ve nöral tüp 1 ventriküler bölgelerinden göç düşünülen oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPC) havuzundan kaynaklanmaktadır. Göç OPC olgun, myelinating oligodendrositlere içine ayırt sonra etkili uyarı iletimini kolaylaştırmak değil, aynı zamanda trofik desteği 2 ile aksonlar sağlamaz sadece. Yetişkin MSS tüm hücrelerin 3 yaklaşık 5-8% oluşan gri ve beyaz cevher boyunca dağılmış OPC bol bir nüfusa tutar. demiyelinizan bir hakaret sonrasında, OPC, yaralanma siteye göç çoğalırlar ve maruz aksonlar kayıp ya da hasarlı miyelin kılıflar yerine ayırt. Ancak, bazı hastalık / yaralanma ayarlarında bu süreç verimsiz olduğu bulunursa veya tamamen 4 başarısız olabilir. SüreKronik demiyelinizasyon belirtileri 5 hafifletmek olabilir hastalığı, verimli oligodendrogenesis ve remiyelinizasyon yükü eklemek için düşünülmektedir. Bu nedenle oligodendrogenesis deneysel faktörlerin etkisini belirlemek için in vitro OPC çalışma ilgi olmuştur.
oligodendrosit farklılaşma farklı evreye Insight sahne spesifik hücre belirteçleri tanımlanması ile mümkün olmuştur. Kendini sürekli yenileyen, erken progenitör hücreler trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa onların ifadesi (PDGFRα) tarafından tanımlanan, sinirsel / glia antijen 2 (NG2) ve A2B5 6-8. OPC kendi farklılaşma programlarının başlatmak ve hücre döngüsünün çekilme olarak, bu markerlerin ifadesinin aşağı ve siklik nükleotid 3'-fosfodiesteraz (CNPase) ve O4 içeren oligodendrositlerin premyelinating göstergesidir proteinleri ifade etmek için başlar. Son olarak, daha fazla erişkin oligodendrositlerin, farklılaşmasıytes myelin-ilintili glikoproteinin (MAG), proteolipid protein (PLP) ve miyelin bazik protein (MBP) gibi miyelin ilişkili proteinlerin ekspresyonu ile karakterize edilir. MBP hücre içi bir çevresel zar proteini ve miyelin kılıfının bir ana bileşenidir. MBP eksik Fare MSS miyelinasyon anlamlı titremeler, kasılmalar ve erken ölüm 9,10 giden azalmış olduğu ciddi bir fenotip geliştirmek. Miyelinasyon MBP bu önemli bir rol, in vitro ve in vivo 11 hem de oligodendrosit farklılaşması için bir markör olarak kullanımına yol açmıştır.
MBP miktarının çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. RT-PCR ve Batı boya analizi Farklı tedavi rejimleri altında MBP seviyelerinin ölçümü için izin verir. Immünsitokimya kamera bazlı mikroskopi yaklaşımlar kullanıldığında da nicel olabilir ortak bir nitel bir yaklaşımdır. Bu sistemler güvenilir ve temel rağmenOligodendrosit farklılaşma çalışması, her bir ilaç taramasında, kullanımlarını sınırlayan kendi dezavantajları vardır. İlk olarak, RT-PCR ve Batı boya analizi için gerekli olan primer OPC miktarı eş zamanlı olarak kontrol edilebilir değişken sayısını azaltır. immünsitokimya hücre gereksinimi çok daha düşük olsa da kantitatif hedefi ise, önemli ölçüde zaman her bir deney için ayrılmış olmalıdır. Sayısız görüntüler yakalanır ve daha sonra deneysel analizi kolaylaştırmak için ölçülebilir olmalıdır. Bu uyarılar yüksek verimlilik değerlendirmesi gerektiren çalışmalar için dikkate almak önemli engeller haline gelir. önemli ölçüde gerekli hücrelerin sayısını ve kantitatif analiz tamamlamak için zaman hem azaltırken Burada, immünsitokimya ve miyelin ölçümü için Western Blot metodolojileri hem temel yönlerini kullanan bir yöntem açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol sıçan OPC izole edilmesi ve deney faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenesis olarak ölçülmesi için hızlı ve güvenilir bir yöntem tarif eder. Pozitif bir seçim kullanarak, canlı ve saf OPC yüksek verimi deneysel amaçlar için doğrudan kullanılır. Bu yöntem, bir 1 haftalık bir zaman çerçevesi içinde izolasyon, kültürlenmesini, ve farklılaşma adımları kolaylaştırır ve sabit hücreler uygun bir deney, hassasiyet kaybı olmaksızın birkaç h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
; Ulusal Sağlık Enstitüleri: sponsor Grant Hibe numarası: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
