العزلة وكيفية تركيب الكانيولا من الشلل متني الشرايين
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
الشرايين متني داخل المخ (PAS)، والتي تشمل الشرايين متني، الشرايين اختراق والشرايين قبل الشعيرات الدموية، والأوعية الدموية مقاومة عالية تتفرع من الشرايين والشرايين حنوني والغوص في لحمة الدماغ. الفردية السلطة الفلسطينية يروي أرض أسطواني منفصلة من لحمة والخلايا العصبية الموجودة داخل. هذه الشرايين هي لاعب رئيسي في تنظيم تدفق الدم الدماغي سواء على الصعيد العالمي (تنظيم ذاتي الدماغية) ومحليا (احتقان وظيفي). المناطق المحمية هي جزء من وحدة وعائية عصبية، هيكل الذي يطابق تدفق الدم الإقليمي في النشاط الأيضي في الدماغ وتشمل أيضا الخلايا العصبية، interneurons والخلايا النجمية. نضح من خلال المناطق المحمية يرتبط ارتباطا مباشرا على نشاط الخلايا العصبية في تلك المنطقة خاصة والزيادات في الصدارة استقلاب الخلايا العصبية إلى زيادة في التروية المحلية الناجمة عن اتساع تغذية السلطة الفلسطينية. تنظيم المحمية يختلف من تميز أفضلالشرايين حنوني. تضيق الأوعية التي يسببها ضغط أكبر في المناطق المحمية وآليات توسيع الاوعيه الدمويه تختلف. وبالإضافة إلى ذلك، لا المحمية لا تتلقى تعصيب خارجي من الأعصاب المحيطة بالأوعية – تعصيب هو جوهري وغير المباشر في الطبيعة من خلال الاتصال مع endfeet نجمي الخلايا. وهكذا، البيانات المتعلقة تنظيم مقلص التي تراكمت الدراسات التي تستخدم الشرايين حنوني لا يترجم مباشرة لفهم وظيفة السلطة الفلسطينية. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يزال غير معروف كيف الحالات المرضية، مثل ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري، وتؤثر على بنية السلطة الفلسطينية والتفاعل. هذه الفجوة المعرفية هي في جزء منه نتيجة للصعوبات التقنية المتعلقة عزل السلطة الفلسطينية وإقناء؛ إدخال القنية. في هذه المخطوطة نقدم بروتوكول لعزل وإقناء؛ إدخال القنية من المناطق المحمية القوارض. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أمثلة من التجارب التي يمكن القيام بها مع هذه الشرايين، بما في ذلك انقباض الناجم عن ناهض للتفاعل عضلي. على الرغم من أن التركيز على هذه المخطوطة على إقناء؛ إدخال القنية السلطة الفلسطينية وتخطيط العضل الضغط وعزل السلطة الفلسطينيةالصورة يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة الكيمياء الحيوية، والفيزيائية الحيوية والجزيئية والتصوير.
Introduction
وينظم الدورة الدموية الدماغية على نحو فريد لدعم مطالب التمثيل الغذائي للخلايا العصبية المركزية، والخلايا التي حدت من مخازن الطاقة وبالتالي فهي حساسة جدا للتغيرات في ضغط الأكسجين وتوريد المواد الغذائية الضرورية. كما معينة القطعان العصبية تصبح نشطة عندما يتم تنفيذ مهام محددة، والأوعية الدموية يعزز زيادة موضعية شديدة في نضح لمنع نقص الأكسجة المحلي واستنزاف المواد الغذائية 1. هذا هو شكل من أشكال احتقان وظيفي المعروفة باسم اقتران الوعائية العصبية، وتعتمد على حسن سير العمل في وحدة وعائية عصبية، يتكون من الخلايا العصبية نشطة، النجمية، والشرايين الدماغية 2. الشرايين متني داخل المخ، مجموعة من الأوعية الدموية التي تشمل متني، اختراق والشرايين قبل شعري، مهمة مركزيا لهذه الاستجابة، ومن ثم حاسما لدراستها بشكل فردي من أجل تحقيق اقتران الوعائية العصبية 3.
<ص الطبقة = "jove_content"> الشرايين متني صغيرة (20-70 ميكرون القطر الداخلي) الأوعية الدموية عالية المقاومة التي يروي السكان العصبية متميزة داخل الدماغ. تتفرع من الشرايين حنوني على السطح، والشرايين متني تخترق لحمة الدماغ في ما يقرب من 90 ᵒ زاوية لتغذية الأوعية الدقيقة تحت سطح الأرض (الشكل 1). هذه الشرايين تلعب دورا حاسما في الحفاظ على ضغط التروية المناسبة كما هي الأوعية التي تحتوي على العضلات الملساء الأكثر القاصي حماية الشعيرات الدموية. في المقابل إلى الدورة الدموية حنوني السطح، الشرايين متني تفتقر إلى فروع جانبية ومفاغرة، وبالتالي هي "عنق الزجاجة" للالدورة الدموية الدماغية 4. ونتيجة لذلك، خلل في الشرايين متني يساهم في تطور الأمراض الدماغية مثل ضعف الأوعية الدموية المعرفي والجلطات الصغيرة (المعروف أيضا باسم السكتات الدماغية الصامتة أو الجوبي). indicat دراساته أن الخلل متني الشرايين يمكن أن يسببها ارتفاع ضغط الدم 5، والإجهاد المزمن 6، وحدثا في وقت مبكر من مرض سفينة صغيرة نموذج الفأر الجيني 7. انسداد وعلاوة على ذلك، التي يسببها تجريبيا من الشرايين اختراق واحدة في الفئران غير كافية لتسبب الجلطات الصغيرة التي هي اسطوانية الشكل، على غرار تلك التي لوحظت في البشر السن 8.وبالإضافة إلى هذه الفروق التشريحية، وآليات تنظيم وظيفة مقلص تختلف بين الشرايين حنوني والشرايين متني. تضيق الأوعية عضلي أكبر في الشرايين متني 9، ربما بسبب عدم وجود تعصيب خارجي 10، وسائط مميزة من mechanotransduction 11، والاختلاف في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يشير 12،13 في خلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية. تشير الدلائل إلى أن آليات عائي تعتمد على البطانة تختلف أيضا بين هذه vascuشرائح لار، مع الشرايين متني واظهار مزيد من الاعتماد على آليات تنطوي الكالسيوم 2+ -activated K + القنوات والاتصالات كهربي توتري داخل جدار الأوعية الدموية مقارنة مع العوامل إنتشاري مثل أكسيد النيتريك وprostacyclins 14. ولذلك، تجمع البيانات في التجارب باستخدام الشرايين حنوني قد لا ينطبق بالضرورة على متني الشرايين، مما يترك فجوة في معرفتنا السيطرة المحلية على التروية الدماغية.
وعلى الرغم من أهميتها، والشرايين متني هي ناقصا إلى حد بعيد درس، ويرجع ذلك أساسا إلى التحديات التقنية مع العزلة وتصاعد للدراسة خارج الحي. في هذه المخطوطة وصفنا منهجية لعزل ويقني؛ يدخل القنية الشرايين متني الدماغية، والتي يمكن استخدامها للضغط تخطيط العضل، أو لعزل الأنسجة لimmunolabeling، الكهربية، وعلم الأحياء الجزيئي، وتحليل الكيمياء الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الشرايين متني الدماغية هي الشرايين مقاومة عالية مع قليل من مفاغرة والفروع التي يروي السكان العصبية واضح. هذه الأوعية الدموية المتخصصة لاعبين المركزي في تنظيم ذاتي الدماغية واقتران الوعائية العصبية من خلال بوساطة نجمية توسع الأوعية 1. وقد عرف أهمية هذه الأوعية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
