Выделение и катетеризация церебральным паренхиматозных артериол
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
Внутримозговые паренхимы артериол (PAS), которые включают в себя паренхимы артериол, проникая артериол и предварительно капиллярные артериол, высокое сопротивление кровеносных сосудов, ветвление из пиальных артерий и артериол и погружения в паренхиму мозга. Индивидуальный PA заливать дискретную цилиндрическую территорию паренхимы и нейроны, содержащиеся в. Эти артериолы являются центральным игроком в регуляции мозгового кровотока как в глобальном масштабе (цереброваскулярные ауторегуляции) и локально (функциональная гиперемия). PAs являются частью нейрососудистое единицы, структура, которая соответствует регионарного кровотока к метаболической активности в головном мозге, а также включает в себя нейроны, интернейронов и астроцитов. Перфузия через ООПТ напрямую связана с активностью нейронов в той или иной территории и увеличение метаболизма нервных клеток, приводят к увеличению в местной перфузии, вызванной дилатации кормов ПА. Регулирование ООПТ отличается от более охарактеризованныйпиальные артерий. Давление индуцированной вазоконстрикции больше в ООПТ и сосудорасширяющие механизмы различаются. Кроме того, ОР не получают примесный иннервации от периваскулярных нервов – иннервации присуща и косвенную в природе через контакт с астроцитов endfeet. Таким образом, данные, касающиеся регулирования сократительной накопленные исследований с использованием пиальных артерий непосредственно не переводят к пониманию функции PA. Кроме того, остается неопределенным, как патологические состояния, такие как гипертония и диабет, влияют на структуру PA и реактивность. Этот пробел в знаниях частично является следствием технических трудностей, связанных с изоляцией ПА и пункции. В этой рукописи мы приводим протокол для изоляции и пункции грызунов ООПТ. Далее, мы покажем примеры экспериментов, которые могут быть выполнены с этими артериол, включая агонист-индуцированную сужением и миогенной реакционной способности. Хотя основное внимание в этой рукописи на П. А. пункции и миографии давления, изолированных PAs также может быть использован для биохимических, биофизических, молекулярных и визуализации исследований.
Introduction
Нарушение мозгового кровообращения однозначно организована для поддержки метаболических потребностей центральных нейронов, клеток, которые имеют ограниченные запасы энергии и являются, следовательно, очень чувствительны к изменениям давления кислорода и поставки необходимых питательных веществ. Как отдельные нейронные субпопуляции становится активным , когда конкретные задачи выполняются, сосудистая сеть способствует высоко локализованное увеличение перфузии , чтобы предотвратить местную гипоксию и истощение питательных веществ 1. Это является одной из форм функциональной гиперемии , известной как нейрососудистое муфте, и зависит от правильной работы нейрососудистое блока, состоящий из активных нейронов, астроциты и мозговых артерий 2. Внутримозговые паренхимы артериол, группа кровеносных сосудов , охватывающих паренхиматозные, проникающих и предварительно капиллярные артериол, центрально важно для этого ответа и тогда критически изучать их по отдельности, чтобы исследовать сосудисто – нервный муфта 3.
<р класс = "jove_content"> паренхиматозных артериол небольшие (20 – 70 мкм, внутренний диаметр) высокого сопротивления кровеносных сосудов, что заливать различные популяции нейронов в головном мозге. Ветвление из пиальных артерий на поверхности, паренхиматозные артериолы проникают в паренхиму мозга при почти 90 ᵒ угла для подачи подповерхностного микроциркуляцию (рисунок 1). Эти артериолы играют решающую роль в поддержании соответствующего перфузионного давления, поскольку они являются наиболее дистальных гладких мышц сосудов, содержащих защитные капилляры. В отличие от циркуляции поверхности пиальных, паренхиматозные артериол отсутствие побочных ветвей и анастомозов, и , следовательно , являются "узкие места" мозгового кровообращения 4. В результате дисфункции паренхиматозных артериол способствует развитию сосудистых заболеваний головного мозга, таких как сосудистый когнитивных нарушений и малых ишемических инсультов (также известный как молчащих или лакунарными ударов). Исследования indicatе , что паренхимы артериол дисфункция может быть вызвана гипертонической 5, 6 хронического стресса и является ранним событием в небольшой болезни сосуда модели генетической мыши 7. Кроме того, экспериментально индуцированной окклюзией одиночных проникающих артериол у крыс достаточно , чтобы вызвать небольшие ишемических инсультов , которые имеют цилиндрическую форму, подобно тем , которые наблюдаются у пожилых людей 8.В дополнение к этим анатомических различий, механизмы регуляции сократительной функции различаются между пиальных артерий и артериол паренхимы. Миогенный вазоконстрикции больше в паренхиматозных артериол 9, возможно , из – за отсутствия внешней иннервации 10 различных режимов механотрансдукции 11, а также различия в внутриклеточного Ca 2+ сигнализации 12,13 в клетках гладких мышц сосудов. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эндотелий-зависимые механизмы сосудорасширяющие также различаются между этими vascuLAR сегменты, с паренхиматозных артериях , проявляющих большую зависимость от механизмов , связанных с Ca 2+ -активированную K + каналы и электротонического связь внутри сосудистой стенки по сравнению с диффундирующих факторов , таких как оксид азота и простациклинов 14. Таким образом, данные, собранные в экспериментах с использованием пиальных артерий может не обязательно относится к паренхиматозных артериол, оставляя пробелы в наших знаниях местного управления перфузии головного мозга.
Несмотря на их важность, паренхиматозные артериолы являются значительно под изученным, в первую очередь из – за технических проблем , с изоляцией и монтажа для изучения экс естественных условиях. В этой рукописи мы описываем методологию для выделения и вводить иглу церебральных паренхиматозных артериолы, которые могут быть использованы для миография давления, или изолировать ткани для иммунноокрашивания, электрофизиологии, молекулярной биологии и биохимического анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Церебральные паренхимы артериол высокие артериол сопротивления с небольшим количеством анастомозов и ветвей, которые заливать различные популяции нейронов. Эти специализированные кровеносные сосуды являются центральными игроками в цереброваскулярной ауторегуляции и нейрососуди?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
