분리 및 대뇌 실질 세동맥의 캐 뉼러
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
실질 소동맥, 관통 소동맥 및 사전 모세관 세동맥을 포함 뇌내 실질 세동맥 (PA는), 뇌 실질에 pial 동맥과 소동맥과 다이빙에서 밖으로 분기 높은 저항 혈관이다. 개별 PA는 실질의 개별 원통형 영역 및 포함 된 뉴런 관류. 이 동맥은 국소 뇌 혈류량 모두 전역 (뇌 자동 조절) 및 (기능 충혈)의 조절에서 중요한 플레이어이다. 전력 증폭기는 신경 혈관 부 뇌 내의 대사 활동 지역 혈류 일치하는 구조의 일부이며 또한 신경의 interneurons 및 성상 세포를 포함한다. 학부모 협의회를 통해 관류 직접 공급 PA의 팽창에 의한 지역 관류의 증가에 특정 지역에서 신경 세포 및 신경 세포의 신진 대사를 리드 증가의 활동에 연결되어 있습니다. 보호 지역의 규제는 더 나은 특징의 차이가pial 동맥. 압력에 의한 혈관 수축은 보호 지역에 크고 혈관 확장 메커니즘은 다양합니다. 또한, PA는 혈관 주위 신경에서 외부 신경 분포를받지 않습니다 – 신경 분포가 성상 세포 endfeet와의 접촉을 통해 고유의 자연에 간접적이다. 따라서, pial 동맥을 사용하여 연구에 의해 축적 된 수축 규제에 관한 데이터를 직접 PA 기능을 이해하는 번역하지 않습니다. 고혈압과 당뇨병과 같은 병적 인 상태는, PA 구조와 반응성에 미치는 영향 또한, 확인되지 않은 남아있다. 이 지식 격차는 부분적으로 PA 분리 및 삽관에 관한 기술적 인 문제의 결과이다. 이 논문에서 우리는 고립과 설치류 보호 지역의 삽관을위한 프로토콜을 제시한다. 또한, 우리는 작용제에 의한 수축과 근육 조직 반응성을 포함하여 이러한 세동맥, 수행 할 수있는 실험의 예를 보여줍니다. 이 논문의 초점은 PA 삽관 및 압력 myography에 있지만, PA 고립S는 또한, 생물 리 학적, 생화학, 분자, 및 이미징의 연구에 사용될 수있다.
Introduction
대뇌 순환 고유 중추 신경 에너지 저장소를 한정 산소 압력과 필요한 영양분 공급의 변화에 따라서 매우 민감 한 세포의 대사 요구 사항을 지원하도록 구성된다. 특정 작업을 수행 할 때 특히 신경 개체군이 활성화 될 때, 혈관 지역 저산소증과 영양분 1의 고갈을 방지하기 위해 관류에 매우 지역화 증가를 촉진한다. 이것은 활성 뉴런, 아스트로 사이트, 및 뇌동맥이 이루어지는, 신경 혈관 결합이라고도 충혈 기능의 한 형태이며, 신경 혈관 장치의 적절한 작동에 의존한다. 뇌내 실질 세동맥은 혈관 실질 포괄 관통 전 모세관 세동맥의 그룹은,이 응답에 대한 중앙 중요하며, 이는 신경 혈관 커플 링 (3)을 조사하기 위해 개별적으로 학습하는 다음 중요하다.
<뇌 내에서 뚜렷한 신경 인구를 관류 – (70 μm의 내경 20) 고 저항 혈관 P 클래스 = "jove_content은"> 실질 소동맥은 작다. 표면에 pial 동맥으로부터 분기, 실질 세동맥은 지하 미세 (그림 1)을 공급하기 위해 거의 90 ᵒ 각도로 뇌 실질에 침투. 이 동맥은 모세관 보호 가장 후방 평활근 함유 혈관과 마찬가지로 적절한 관류 압력을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 표면 pial 순환 달리 실질 세동맥 담보 지점과 문합이 부족하고, 그 결과 뇌 순환 (4)의 "병목 현상"이다. 이 결과, 실질 세동맥의 혈관 장애는인지 손상 및 작은 허혈성 뇌졸중 (또한 자동 또는 열공 스트로크로 알려진)와 같은 뇌 혈관 질환의 발전에 기여한다. 연구 indicat전자가 실질 동맥 부전은 본 태성 고혈압 (5), 만성 스트레스 (6)에 의해 유도, 작은 혈관 질환 유전 마우스 모델 7의 초기 이벤트입니다 수 있습니다. 쥐 단일 관통 세동맥의 추가의 실험적 유도 폐색 이전 인간 8에서 관찰되는 원통형, 유사한 작은 허혈성 뇌졸중을 야기하기에 충분하다.이러한 해부학 적 차이에 더하여, 수축 기능을 조절하는 메커니즘 pial 동맥 및 실질 세동맥 사이에서 다르다. 근육 조직 수축이 가능하기 때문에, 혈관 평활근 세포에서 세포 내 신호 전달 12,13 CA의 외인성 신경 분포 10 mechanotransduction (11)의 고유 모드와 다름이 부족 2+, 실질 세동맥 9 크다. 증거는 내피 세포 의존성 혈관 확장 메커니즘은 이러한 vascu 사이에 차이가 있음을 시사한다칼슘을 포함하는 메커니즘에 더 의존을 나타내는 실질 동맥과 LAR 세그먼트는, 이러한 산화 질소와 prostacyclins (14) 확산 요인에 비해 혈관 벽에서 K + 채널과 electrotonic 통신을 부활. 따라서, 데이터는 뇌 관류의 로컬 제어에 대한 지식의 격차를 떠나, 반드시 세동맥을 실질에게 적용되지 않을 수도 있습니다 pial 동맥을 사용하여 실험에 모였다.
그 중요성에도 불구하고, 실질 동맥은 주로 인해 분리 및 생체 연구 실장과 기술적 인 도전에, 아래에 연구 된 광대입니다. 이 논문에서는 분리 압력 myography 사용될 수 있거나 immunolabeling, 전기 생리학, 분자 생물학 및 생화학 적 분석을위한 조직을 분리하는 뇌 실질 세동맥을 cannulate하는 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대뇌 실질 소동맥은 별개의 신경 세포 인구를 관류 몇 문합, 분기와 고 저항 세동맥입니다. 이러한 전문 혈관 성상 세포 매개 성 혈관 확장 (1)을 통해 뇌 혈관 자동 조절 및 신경 혈관 커플 링의 중심 선수입니다. 뇌 혈관 질환에서 이러한 전문 혈관의 중요성은 박사 밀러 피셔의 선구적인 작품은 고혈압 환자 사후 16의 뇌에서 열공 경색의 영토 내에서 실질 동맥의 구조 변경…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
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