Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
arteríolas parênquima intracerebrais (PAs), que incluem arteríolas parênquima, arteríolas penetrantes e arteríolas pré-capilares, são os vasos sanguíneos de alta resistência que ramificam para fora das artérias e arteríolas pial e mergulhar no parênquima cerebral. PA indivíduo perfundir um território cilíndrica discreta do parênquima e os neurônios contidos. Essas arteríolas é um jogador central na regulação do fluxo sanguíneo cerebral, tanto globalmente (autorregulação vascular cerebral) e localmente (hiperemia funcional). PAs são parte da unidade neurovascular, uma estrutura que corresponde ao fluxo sanguíneo regional de actividade metabólica no interior do cérebro e também inclui neurónios, astrócitos e interneurónios,. Perfusão através PAs está diretamente ligado à atividade de neurônios em que determinado território e aumentos de chumbo metabolismo neuronal a um aumento na perfusão local causado pela dilatação do feed PA. Regulamento das AP é diferente do melhor caracterizadaartérias pial. vasoconstrição induzida pela pressão é maior nos PAs e mecanismos vasodilatadores variar. Além disso, PAs não recebem a inervação extrínseca dos nervos perivasculares – inervação é intrínseca e indireta na natureza através do contato com endfeet astrocitário. Assim, os dados relativos a regulação contrátil acumuladas pelos estudos utilizando artérias pial não se traduz diretamente para a compreensão da função PA. Além disso, permanece indeterminada como os estados patológicos, tais como hipertensão e diabetes, afetar a estrutura PA e reactividade. Essa lacuna de conhecimento é, em parte, uma consequência das dificuldades técnicas relativas ao isolamento PA e canulação. Neste artigo apresentamos um protocolo para o isolamento e canulação de PAs de roedores. Além disso, mostramos exemplos de experiências que podem ser realizadas com estas arteríolas, incluindo constrição induzida por agonista e reactividade miogénica. Embora o foco deste artigo é sobre PA canulação e Miografia pressão, isolado PAs também pode ser utilizado para estudos bioquímicos, biofísicos, moleculares, e de imagem.
Introduction
A circulação cerebral é organizado exclusivamente para suportar as demandas metabólicas dos neurônios centrais, células que têm limitado as reservas de energia e, consequentemente, eram altamente sensíveis a mudanças na pressão de oxigênio e fornecimento de nutrientes necessários. Como particulares subpopulações neuronais torna ativo quando tarefas específicas são realizadas, a vasculatura promove um aumento altamente localizada na perfusão para evitar hipóxia local e esgotamento de nutrientes 1. Esta é uma forma de hiperemia funcional conhecida como acoplamento neurovascular, e depende do funcionamento adequado da unidade neurovascular, composto de neurónios, astrócitos, activas e artérias cerebrais 2. Arteríolas parênquima intracerebrais, um grupo de vasos sanguíneos que abrangem parênquima, penetrantes e arteríolas pré-capilares, são centralmente importante para esta resposta e é então crítica para estudá-los individualmente a fim de investigar o acoplamento neurovascular 3.
<p class = "jove_content"> arteríolas parenquimatosas são pequenas (20-70 mm de diâmetro interno) vasos sanguíneos de alta resistência que perfundem populações neuronais distintas dentro do cérebro. Ramificação para fora a partir de artérias piais na superfície, arteríolas parenquimatosas penetrar no parênquima cerebral em um ângulo de cerca de 90 ᵒ para alimentar a microcirculação subsuperfície (Figura 1). Estes arteríolas desempenhar um papel crítico na manutenção da pressão de perfusão adequada, tal como eles são os vasos contendo musculares lisas mais distais que protegem os capilares. Em contraste com a circulação pial superfície, arteríolas parenquimatosas falta ramos colaterais e anastomose, e, consequentemente, são "estrangulamento" da circulação cerebral 4. Como resultado, a disfunção das arteríolas parenquimatosas contribui para o desenvolvimento de doenças cerebrovasculares, tais como comprometimento cognitivo vascular e pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos (também conhecido como acidentes vasculares cerebrais silenciosas ou lacunares). estudos indicade que a disfunção do parênquima arteríolas pode ser induzida por hipertensão essencial 5, stress crónico 6, e é um evento precoce em doença dos pequenos vasos modelo de ratinho genética 7. Oclusão Além disso, induzida experimentalmente das arteríolas penetrantes única em ratos é suficiente para causar pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos, que são de forma cilíndrica, semelhante aos observados em humanos mais velhos 8.Além dessas distinções anatômicas, mecanismos que regulam a função contrátil diferem entre artérias e arteríolas pial do parênquima. Vasoconstrição Miogênica é maior nas arteríolas parenquimatosas 9, possivelmente devido à falta de inervação extrínseca 10, modos distintos de mecanotransdução 11, e diferenças no Ca2 + intracelular de sinalização 12,13 nas células musculares lisas vasculares. A evidência sugere que os mecanismos vasodilatadores dependentes do endotélio também diferem entre estes vascusegmentos Lar, com artérias do parênquima que exibem uma maior confiança nos mecanismos que envolvem Ca 2+ -activated canais de K + e comunicação eletrotônicos dentro da parede vascular em comparação com fatores difus�eis tais como óxido nítrico e prostaciclinas 14. Portanto, os dados reunidos em experimentos usando artérias pial pode não se aplicam necessariamente a do parênquima arteríolas, deixando uma lacuna no nosso conhecimento sobre o controle local da perfusão cerebral.
Apesar da sua importância, arteríolas do parênquima são vastamente sub-estudado, principalmente devido aos desafios técnicos com isolamento e de montagem para o estudo ex vivo. Neste artigo é descrita uma metodologia para isolar e canular arteríolas do parênquima cerebral, o que pode ser utilizado para Miografia pressão, ou para isolar o tecido por imunomarcação, electrofisiologia, biologia molecular, bioquímica e análise.
Protocol
Representative Results
Discussion
arteríolas parênquima cerebral são arteríolas de alta resistência com poucas anastomoses e ramos que perfundem populações neuronais distintas. Estes vasos sanguíneos especializados são jogadores centrais na auto-regulação cerebrovascular e acoplamento neurovascular através de vasodilatação mediada por astrócitos 1. A importância destes vasos sanguíneos especializados na doença vascular cerebral é conhecida há aproximadamente 50 anos, quando o trabalho pioneiro do Dr. Miller Fisher descreve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
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