Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
Intracerebrale parenchymale arteriolen (PA's), die parenchymale arteriolen, indringende arteriolen en pre-capillaire arteriolen omvatten, zijn hoge weerstand bloedvaten vertakking van pial slagaders en arteriolen en duiken in de hersenen parenchym. Individuele PA perfuseren een discrete cilindrische grondgebied van het parenchym en de neuronen in ons systeem. Deze arteriolen zijn een centrale speler in de regulatie van de cerebrale doorbloeding zowel wereldwijd (cerebrovasculaire autoregulatie) en lokaal (functionele hyperemie). PA's maken deel uit van de neurovasculaire eenheid, een structuur die overeenkomt doorbloeding metabole activiteit in de hersenen en ook neuronen, interneuronen en astrocyten. Perfusie met PA is direct gekoppeld aan de activiteit van neuronen in dat gebied en een toename van neuronale metabolisme leiden tot een verhoging in lokale perfusie veroorzaakt door dilatatie van de voeding PA. Regulatie van PA verschilt van die beter gekarakteriseerdepiale slagaders. -Druk-geïnduceerde vaatvernauwing is groter in de Pas en vaatverwijdende mechanismen variëren. Daarnaast hebben PA niet extrinsieke innervatie ontvangen van perivasculaire zenuwen – innervatie is intrinsieke en indirect in de natuur door contact met astrocytische uiteinde. Dus, gegevens met betrekking tot contractiele regulering opgebouwd door studies met pial slagaders niet direct te vertalen naar het begrijpen van PA-functie. Verder blijft onbepaald hoe pathologische toestanden, zoals hypertensie en diabetes, beïnvloeden PA structuur en reactiviteit. Deze leemte is deels het gevolg van de technische problemen in verband met PA isolatie en canule. In dit manuscript presenteren we een protocol voor isolatie en infusen van knaagdieren PA's. Verder tonen we voorbeelden van experimenten die zijn uitgevoerd met deze arteriolen, waaronder agonist veroorzaakte vernauwing en myogene reactiviteit. Hoewel de focus van dit manuscript is op de PA infusen en de druk myography, geïsoleerde PAB kan ook worden gebruikt voor biochemische, biofysische, moleculaire en beeldvormende studies.
Introduction
De cerebrale circulatie is uniek georganiseerd om de metabolische behoeften van centrale neuronen, cellen die energieopslag beperkte en daardoor zeer gevoelig voor veranderingen in de zuurstofspanning en aanvoer van noodzakelijke voedingsstoffen ondersteunen. De bijzondere neuronale subpopulaties actief wordt wanneer specifieke taken worden uitgevoerd, het vaatstelsel bevordert een sterk gelokaliseerde toename van perfusie plaatselijke hypoxie en uitputting van voedingsstoffen 1 voorkomen. Dit is een vorm van functionele hyperemie bekend als neurovasculaire koppeling, en is afhankelijk van de goede werking van de neurovasculaire eenheid, bestaande uit actieve neuronen, astrocyten en cerebrale arteriën 2. Intracerebrale parenchymale arteriolen, een groep van bloedvaten omvat parenchymale doordringende en precapillaire arteriolen, zijn centraal belang voor deze reactie en het is dan cruciaal bij de losse bestuderen om neurovasculaire koppeling 3 onderzoeken.
<p class = "jove_content"> Parenchymale arteriolen zijn klein (20-70 urn inwendige diameter) hoge weerstand bloedvaten die verschillende neuronale populaties in de hersenen perfuseren. Vertakking van pial slagaders op het oppervlak, parenchymale arteriolen doordringen in de hersenen parenchym in een bijna 90 ᵒ hoek met de ondergrond microcirculatie (figuur 1) te voeden. Deze arteriolen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de juiste perfusiedruk zoals ze zijn de meest distale gladde spier opslagvaten de bescherming van de haarvaten. In tegenstelling tot het oppervlak pial circulatie parenchymale arteriolen gebrek zijtakken en anastomosen, en zijn daarom "knelpunten" van de cerebrale circulatie 4. Hierdoor disfunctie van parenchymale arteriolen bijdraagt tot de ontwikkeling van cerebrovasculaire ziekten zoals vasculaire cognitieve stoornissen en kleine ischemische beroerte (ook bekend als stille of lacunaire beroerte). studies indicate dat parenchymale arteriolen disfunctie kan worden geïnduceerd door 5 essentiële hypertensie, chronische stress 6, en is een vroege gebeurtenis in SVD genetisch muismodel 7. Verder experimenteel geïnduceerde occlusie van één penetrerend arteriolen bij ratten voldoende kleine ischemische beroerte die cilindrisch van vorm, vergelijkbaar die waargenomen bij oudere mensen 8 veroorzaken.Naast deze anatomische verschillen, mechanismen reguleren contractiele functie verschillen pial arteriën en arteriolen parenchym. Myogene vasoconstrictie groter in parenchymale arteriolen 9, mogelijk vanwege het gebrek aan extrinsieke innervatie 10, verschillende modi van mechanotransductie 11, en verschillen in intracellulaire Ca2 + signalering 12,13 in vasculaire gladde spiercellen. Er zijn aanwijzingen dat endotheel-afhankelijke vasodilator mechanismen ook verschillen tussen deze VascuLAR segmenten, met parenchymale slagaders vertonen grotere afhankelijkheid van mechanismen die Ca 2+ geactiveerde K + kanalen en elektrotone communicatie binnen de vaatwand in vergelijking met diffundeerbare factoren zoals stikstofoxide en prostacyclinen 14. Daarom verzamelde gegevens in experimenten met pial slagaders kan niet noodzakelijk van toepassing op arteriolen parenchymale, waardoor er een gat in onze kennis van de lokale controle van de hersendoorbloeding.
Ondanks het belang ervan, parenchymale arteriolen zijn enorm onder bestudeerde, voornamelijk als gevolg van de technische uitdagingen met isolatie en bevestiging voor ex vivo studie. In dit manuscript beschrijven we een methode voor het isoleren en canule cerebrale parenchym arteriolen, die kan worden gebruikt voor druk- myography of om weefsel te isoleren voor immunokleuring, elektrofysiologie, moleculaire biologie en biochemische analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebral parenchymale arteriolen zijn hoge weerstand arteriolen met weinig anastomoses en takken die verschillende neuronale populaties perfuseren. Deze gespecialiseerde bloedvaten centrale spelers in cerebrovasculaire autoregulatie en neurovasculaire koppeling through-astrocyten gemedieerde vaatverwijding 1. Het belang van deze gespecialiseerde bloedvaten in cerebrale vasculaire ziekte is gekend voor ongeveer 50 jaar, toen het pionierswerk van Dr. Miller Fisher beschreven structurele veranderingen in parench…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
