Isolement et Cannulation de parenchyme cérébral artérioles
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
artérioles intracérébrales parenchymateuses (AP), qui comprennent les artérioles parenchyme, artérioles pénétrantes et artérioles pré-capillaires, sont très résistants vaisseaux sanguins se ramifient des artères et des artérioles piales et plonger dans le parenchyme cérébral. Individuel PA perfuser un territoire cylindrique discret du parenchyme et les neurones contenus dans. Ces artérioles sont un acteur central dans la régulation du flux sanguin cérébral tant au niveau mondial (d'autorégulation cérébrovasculaire) et localement (hyperémie fonctionnelle). AP font partie de l'unité neurovasculaire, une structure qui correspond à la circulation sanguine régionale de l'activité métabolique dans le cerveau et comprend également des neurones, des astrocytes et des interneurones. Perfusion par AP est directement liée à l'activité des neurones dans ce territoire particulier et l'augmentation des neurones du métabolisme conduisent à une augmentation de la perfusion locale provoquée par la dilatation de l'alimentation PA. Règlement des AP diffère de celui de mieux caractériséartères piales. vasoconstriction induite par la pression est plus grande dans les AP et les mécanismes vasodilatateurs varient. En outre, les AP ne reçoivent pas innervation extrinsèque des nerfs périvasculaires – innervation est intrinsèque et de nature indirecte par contact avec endfeet astrocytaire. Ainsi, les données relatives à la régulation contractile accumulées par des études utilisant des artères piales ne se traduit pas directement à la compréhension de la fonction PA. En outre, il reste à déterminer comment les états pathologiques, comme l'hypertension et le diabète, affectent la structure PA et réactivité. Cette lacune est en partie la conséquence des difficultés techniques liées à l'isolement PA et cathétérisme. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole pour l'isolement et la canulation des AP de rongeurs. De plus, nous montrons des exemples d'expériences qui peuvent être effectués avec ces artérioles, y compris la constriction induite par l'agoniste et de la réactivité myogénique. Bien que l'accent de ce manuscrit est sur canulation PA et myographie de pression, isolé PAs peuvent également être utilisés pour des études biochimiques, biophysiques, moléculaires, et d'imagerie.
Introduction
La circulation cérébrale est organisée uniquement pour soutenir les besoins métaboliques de neurones centraux, les cellules qui ont limité les réserves d'énergie et sont par conséquent très sensible aux variations de la pression d'oxygène et d'éléments nutritifs nécessaires. Comme particulier neuronaux sous – populations devient actif lorsque des tâches spécifiques sont effectuées, la vascularisation favorise une augmentation très localisée de la perfusion pour éviter l' hypoxie locale et de l' épuisement des éléments nutritifs 1. Ceci est une forme d'hyperémie fonctionnelle connue sous le nom de couplage neurovasculaire, et dépend du bon fonctionnement de l'unité neurovasculaire, composée de neurones actifs, les astrocytes et les artères cérébrales 2. Artérioles parenchyme intracérébrales, un groupe de vaisseaux sanguins englobant parenchymateuse, pénétrantes et artérioles pré-capillaires, sont importants au centre de cette réponse et il est alors essentiel de les étudier individuellement afin d'étudier le couplage neurovasculaire 3.
<p class = "jove_content"> artérioles parenchymateuses sont petites (20-70 um de diamètre interne) à haute résistance des vaisseaux sanguins qui irriguent les populations neuronales distinctes dans le cerveau. Branching out des artères piales sur la surface, artérioles parenchyme pénètrent dans le parenchyme cérébral à près de 90 ᵒ angle pour alimenter la microcirculation du sous – sol (figure 1). Ces artérioles jouent un rôle crucial dans le maintien de la pression de perfusion appropriée car ils sont des vaisseaux les plus distaux contenant des muscles lisses qui protègent les capillaires. Contrairement à la circulation pial de surface, artérioles parenchyme manquent branches collatérales et anastomoses, et par conséquent sont des «goulets d' étranglement» de la circulation cérébrale 4. En conséquence, le dysfonctionnement des artérioles parenchymales contribue au développement de maladies vasculaires cérébrales telles que l'altération cognitive vasculaire et les petits accidents vasculaires cérébraux ischémiques (également connu comme AVC silencieux ou lacunaires). études iNDICATe que la dysfonction parenchyme artérioles peut être induite par l' hypertension artérielle essentielle 5, le stress chronique 6, et est un événement précoce dans maladie des petits vaisseaux modèle de souris génétique 7. Occlusion En outre, induite expérimentalement des artérioles pénétrantes simples chez les rats est suffisante pour causer de petits accidents vasculaires cérébraux ischémiques qui sont de forme cylindrique, semblable à celles observées chez les humains âgés de 8.En plus de ces distinctions anatomiques, mécanismes de régulation de la fonction contractile diffèrent entre les artères et artérioles piales parenchymateuses. Myogénique vasoconstriction est plus grande dans les artérioles parenchymales 9, probablement en raison de l'absence d'innervation extrinsèque 10, modes distincts de transduction mécanique 11, et des différences dans la signalisation intracellulaire de Ca2 + 12,13 dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Les preuves suggèrent que les mécanismes de vasodilatateurs endothélium-dépendante diffèrent également entre ces vascusegments lar, avec les artères parenchymateuses présentant une plus grande dépendance à l' égard des mécanismes impliquant Ca 2+ -activated canaux K + et communication électrotonique au sein de la paroi vasculaire par rapport aux facteurs diffusibles tels que l' oxyde nitrique et prostacyclines 14. Par conséquent, les données recueillies dans des expériences utilisant des artères piales peuvent pas nécessairement à parenchymateuse artérioles, laissant un vide dans nos connaissances sur le contrôle local de perfusion cérébrale.
Malgré leur importance, les artérioles parenchyme sont largement sous-étudiées, principalement en raison des difficultés techniques avec l' isolation et de montage pour ex vivo étude. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour isoler et cathétériser artérioles parenchymateuses cérébrales, qui peut être utilisé pour myographie sous pression ou pour isoler les tissus à des fins immunomarquage, électrophysiologie, la biologie moléculaire et de l'analyse biochimique.
Protocol
Representative Results
Discussion
artérioles parenchyme cérébral sont artérioles de résistance élevée avec quelques anastomoses et les branches qui irriguent populations neuronales distinctes. Ces vaisseaux sanguins spécialisés sont des acteurs centraux dans l' autorégulation cérébrovasculaire et le couplage neurovasculaire par astrocyte médiée par vasodilatation 1. L'importance de ces vaisseaux sanguins spécialisés dans les maladies vasculaires cérébrales est connue depuis environ 50 ans, lorsque le travail de pionn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
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