Isolasjon og kanylering av Cerebral Parenkymalt arterioler

Summary

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Abstract

Intracerebrale parenkymceller arterioler (PAS), som inkluderer parenkymatøs arterioler, gjennomtrengende arterioler og pre-kapillær arterioler, er høy motstand blodkar forgrening ut fra pial arterier og arterioler og dykke inn i hjernen parenchyma. Individuell PA perfuse en diskret sylindrisk territorium parenchyma og nervecellene som finnes. Disse arterioler er en sentral aktør i reguleringen av cerebral blodstrøm både globalt (cerebrovaskulær autoregulation) og lokalt (funksjonell hyperemia). PAs er en del av neurovascular enhet, en struktur som tilsvarer regionale blodstrømmen til metabolsk aktivitet i hjernen og omfatter også nevroner, interneuroner og astrocytter. Perfusjon gjennom PAs er direkte knyttet til aktiviteten av neuroner i det aktuelle område og økning i nevronal metabolisme fører til en styrking i lokal perfusjon forårsaket av utvidelse av foret PA. Regulering av PAs skiller seg fra bedre-pregetpial arterier. Pressure-indusert vasokonstriksjon er større i PAS og vasodilaterende mekanismer variere. I tillegg trenger PAs ikke får ytre innervasjon fra perivaskulær nerver – innervasjon er egenverdi og indirekte i naturen gjennom kontakt med astrocytic endfeet. Dermed data om kontraktile regulering akkumulert av studier med pial arterier ikke direkte oversette til å forstå PA funksjon. Videre er det fortsatt ikke avklart hvordan patologiske tilstander som høyt blodtrykk og diabetes, påvirker PA struktur og reaktivitet. Dette kunnskapsgapet er delvis en konsekvens av tekniske problemer knyttet til PA isolasjon og kanylering. I dette manuskriptet presenterer vi en protokoll for isolasjon og kanylering av gnager PAS. Videre viser vi eksempler på forsøk som kan utføres med disse arterioler, inkludert agonist-indusert konstriksjon og myogenisk reaktivitet. Selv om fokus for dette manuskriptet er på PA kanylering og trykk myography, isolert PAs kan også benyttes for biokjemiske, biofysiske, molekylære, og avbildningsstudier.

Introduction

Den cerebral sirkulasjon er unikt organisert for å understøtte de metabolske kravene til sentralnerveceller, celler som har begrenset energilager, og er følgelig meget følsomme for endringer i oksygentrykk og tilførsel av nødvendige næringsstoffer. Som spesielle nerve subpopulasjoner blir aktive når bestemte oppgaver utføres, fremmer blodkar et sterkt lokalisert økning i perfusjon å hindre lokal hypoksi og utarming av næringsstoffer ^1. Dette er en form for funksjonell hyperemia kjent som neurovaskulær kopling, og er avhengig av riktig drift av neurovascular enhet, som består av aktive neuroner, astrocytter og cerebrale arterier ^2. Intracerebrale parenchymale arterioler, en gruppe av blodkar som omfatter parenkymal, gjennomtrengende og pre-kapillære arterioler, er sentralt viktig for denne reaksjon, og det er da viktig å studere dem enkeltvis for å undersøke neurovascular kopling ^3.

<p class = "jove_content"> parenchymale arterioler er små (20-70 nm indre diameter) med høy motstand blodkar som perfuse distinkte neuronpopulasjoner i hjernen. Forgrening ut fra pial arterier på overflaten, parenchymale arterioler trenge inn i hjernen parenchyma ved en nesten 90 ^ᵒ vinkel til mate undergrunnen mikrosirkulasjon (figur 1). Disse arterioler spille en avgjørende rolle i å opprettholde passende perfusjonstrykk som de er de mest distale glatte muskel-oppbevaringsbeholdere som beskytter kapillærer. I motsetning til overflaten pial sirkulasjon, parenchymale arterioler mangler sikkerhet grener og anastomoser, og følgelig er "flaskehalser" av cerebral sirkulasjon ^4. Som et resultat av dysfunksjon av parenchymale arterioler bidrar til utvikling av cerebrovaskulære sykdommer så som vaskulær demens og små iskemisk slag (også kjent som tause eller lakunære slag). studier .indikatorere at parenchymal arterioler dysfunksjon kan induseres ved essensiell hypertensjon ^5, kronisk stress ^6, og er en tidlig begivenhet i småkarssykdom genetisk musemodell ^7. Videre er eksperimentelt-indusert okklusjon av enkle penetrerende arterioler i rotter er tilstrekkelig til å forårsake små iskemisk slag som er sylindrisk i form, tilsvarende det som ble observert hos eldre mennesker ^8.

I tillegg til disse anatomiske forskjeller, mekanismer som regulerer kontraktile funksjon varierer mellom pial arterier og parenkymatøs arterioler. Myogenisk vasokonstriksjon er større i parenchymale arterioler ^9, muligens på grunn av den manglende ytre innervasjon ^10, distinkte måter mechanotransduction ^11, og forskjeller i intracellulær Ca2 ⁺ signale ^12,13 i vaskulære glatte muskelceller. Tyder på at endotel-avhengig vasodilaterende mekanismer også variere mellom disse vascuLar segmenter, med parenkymceller arterier stiller større avhengighet av mekanismer som involverer Ca ^2+-aktivert K ⁺ -kanaler og electrotonic kommunikasjon i karveggen sammenlignet med diffusible faktorer som nitrogenoksid og prostacykliner ^14. Derfor data samlet i eksperimenter med pial arterier kan ikke nødvendigvis gjelder for parenkymatøs arterioler, etterlot et tomrom i vår kunnskap om lokal kontroll av cerebral perfusjon.

Til tross for sin betydning, parenkymceller arterioler er langt under-studert, hovedsakelig på grunn av de tekniske utfordringene med isolasjon og montering for ex vivo studier. I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å isolere og cannulate cerebrale parenkymceller arterioler, som kan brukes for trykk myography, eller for å isolere vev for immunolabeling, elektrofysiologi, molekylær biologi, og biokjemisk analyse.

Protocol

1. Kanyle og Chamber Forberedelse Sett ren borosilikatglass kapillærer (ytre diameter: 1,2 mm, indre diameter: 0,69 mm; 10 mm i lengde) inn i sporene til en pipette puller med en platina-filament (diameter 100 pm). Bruke riktige innstillingene, trekk kapillær å generere en kanyle med en lang og tynn spiss (figur 2) med en mikropipette avtrekker. Innstillingene som brukes er: Heat – 700, Pull – 100, Velocity – 50, Time – 10. Sett kanylen inn i holderen av trykk myograph …

Representative Results

Figur 5A viser en representativ innsnevring av mus PAS til 60 mM KCl aCSF å evaluere integriteten av preparatet. PAs skal innsnevre mellom 15 – 30%, i nærvær av 60 mM KCl. Hvis innsnevringen er under 15%, forkaste PA og cannulate en annen, så det tyder på at arteriole ble skadet under isolasjon og kanylering prosess. Figur 5B illustrerer PA innsnevringen til økende konsentrasjoner av tro…

Discussion

Cerebral parenkymceller arterioler er høy motstand arterioler med få anastomoser og greiner som perfuse forskjellige nevronale populasjoner. Disse spesialiserte blodårer er sentrale aktører i cerebrovaskulær autoregulation og nevrovaskulære kobling gjennom astrocyte-mediert vasodilatasjon ^en. Betydningen av disse spesialiserte blodårer i cerebral vaskulær sykdom har vært kjent i ca 50 år, når det banebrytende arbeidet til Dr. Miller Fisher beskrevet strukturelle endringer i parenkymceller arteriole…

Materials

artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation/ Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μL	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B