Isolering och kanylering av cerebral parenkymal arterioler
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
Intracerebrala parenkymala arterioler (PA), som omfattar parenkymala arterioler, penetrerande arterioler och pre-kapillära arterioler, är höga motstånds blodkärl förgrenar sig från pial artärer och arterioler och dykning i hjärnparenkymet. Individuell PA BEGJUTA en diskret cylindrisk territorium parenkymet och nervceller som finns i. Dessa arterioler är en central aktör i regleringen av det cerebrala blodflödet både globalt (cerebrovaskulär auto) och lokalt (funktionell hyperemi). PAs är en del av den neurovaskulära enheten, en struktur som matchar det regionala blodflödet till metabolisk aktivitet i hjärnan och inkluderar också neuroner, interneuronen, och astrocyter. Perfusion genom PA är direkt kopplad till aktiviteten av neuroner i det aktuella området och ökningar av neuronal metabolism leder till en ökning i lokal perfusion på grund av utvidgning av fodret PA. Reglering av PA skiljer sig från bättre karaktäriseradepial artärer. Tryck inducerad kärlsammandragning är större i Pas och kärlvidgande mekanismer varierar. Dessutom har PA inte ta emot yttre innervation från perivaskulära nerverna – innervation är inneboende och indirekt i naturen genom kontakt med astrocytisk endfeet. Således inte uppgifter om kontraktila reglering ackumulerade av studier med pial artärer inte direkt översätta till förstå PA funktion. Vidare är det fortfarande obestämd hur patologiska tillstånd, såsom högt blodtryck och diabetes, påverkar PA struktur och reaktivitet. Denna kunskapsluckorna är delvis en följd av de tekniska svårigheterna avseende PA isolering och kanyle. I detta manuskript presenterar vi ett protokoll för isolering och kanylering av gnagare PA. Vidare visar vi exempel på experiment som kan utföras med dessa arterioler, inklusive agonistinducerad sammandragning och myogenic reaktivitet. Även om fokus i detta manuskript är på PA kanyle och tryck myography isolerade PAs kan också användas för biokemiska, biofysiska, molekylära och avbildningsstudier.
Introduction
Den cerebral cirkulation är unikt organiseras för att stödja de metaboliska kraven på centrala neuroner, celler som har begränsad energiförråd och är därför mycket känsliga för förändringar i syretryck och leverans av nödvändiga näringsämnen. Som särskilda neuronala subpopulationer blir aktiv när specifika uppgifter utförs, främjar kärl en mycket lokal ökning av perfusion för att förhindra lokal hypoxi och utarmning av näringsämnen 1. Detta är en form av funktionell hyperemi kallas neurovaskulära koppling, och är beroende av väl fungerande neurovaskulära enhet, som består av aktiva nervceller, astrocyter och hjärnans kärl 2. Intracerebrala parenkymala arterioler, en grupp av blodkärl omfattar parenkymal, genomträngande och pre-kapillära arterioler, är centralt viktiga för detta svar och det är då viktigt att studera dem individuellt för att undersöka neurovaskulära koppling 3.
<p class = "jove_content"> parenkymal arterioler är små (20-70 um innerdiameter) högresistenta blodkärl som BEGJUTA distinkta neuronala populationer i hjärnan. Förgrenar sig från pial artärer på ytan, parenkymala arterioler tränga in i hjärnparenkymet på en nästan 90 ᵒ vinkel för att mata ytan mikro (Figur 1). Dessa arterioler spelar en avgörande roll för att upprätthålla lämplig perfusionstryck eftersom de är de mest distala glatta muskelceller innehåller fartyg som skyddar kapillärerna. I motsats till ytan pial cirkulationen, parenkymala arterioler saknar kollaterala grenar och anastomoser, och följaktligen är "flaskhalsar" i den cerebrala cirkulationen 4. Som ett resultat, dysfunktion av parenkymala arterioler bidrar till utvecklingen av cerebrovaskulära sjukdomar, såsom vaskulär kognitiv svikt och små ischemisk stroke (även kallad tyst eller lakunära stroke). studier indicate att parenkymal arterioler dysfunktion kan induceras av essentiell hypertoni 5, kronisk stress 6, och är en tidig händelse i litet kärl sjukdom genetisk musmodell 7. Vidare, experimentellt inducerad ocklusion av enstaka penetrerande arterioler hos råttor är tillräcklig för att orsaka små ischemisk stroke som är cylindrisk form, liknande dem som observerats hos äldre människor 8.Utöver dessa anatomiska skillnader, mekanismer som reglerar kontraktila funktion skiljer sig mellan pial artärer och parenkymal arterioler. Myogenic vasokonstriktion är större i parenkymala arterioler 9, möjligen på grund av bristen på yttre innervation 10 olika lägen av mechanotransduction 11, och skillnader i intracellulär Ca2 + signalering 12,13 i vaskulära glatta muskelceller. Uppgifter tyder på att endotelberoende kärlvidgande mekanismer skiljer sig också mellan dessa Vascunande segment, med parenkymala artärer uppvisar större tillit till mekanismer som inbegriper Ca2 + -activated K + -kanaler och electrotonic kommunikation inom kärlväggen jämfört med diffunderbara faktorer såsom kväveoxid och prostacykliner 14. Därför samlades data i experiment med användning av pial artärer inte nödvändigtvis gälla parenkymala arterioler, lämnar en lucka i vår kunskap om lokal styrning av cerebral perfusion.
Trots sin betydelse, parenkymala arterioler är väldigt under studerade, främst på grund av de tekniska utmaningarna med isolering och montering för ex vivo-studie. I detta manuskript beskriver vi en metod för att isolera och kanylera cerebrala parenkymala arterioler, som kan användas för tryck myography, eller för att isolera vävnad för immunmärkningen, elektrofysiologi, molekylärbiologi, och biokemisk analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebrala parenkymala arterioler är hög motstånds arterioler med få anastomoser och grenar som BEGJUTA distinkta neuronala populationer. Dessa specialiserade blodkärl är centrala aktörer i cerebrovaskulär auto och neurovaskulära koppling genom astrocyternas-medierad vasodilatation 1. Betydelsen av dessa specialiserade blodkärl i cerebral kärlsjukdom har varit känt i ca 50 år, då pionjärarbete av Dr Miller Fisher beskrev strukturella förändringar i parenkymala arterioler inom territorier lakun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
