In Vitro Cultuur van epicardiale cellen uit muis embryonale Heart
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
Een schat aan experimentele gegevens hebben aangetoond dat het epicard beïnvloedt kritische stappen in de ontwikkeling van het hart. Tijdens de ontwikkeling, het septum transversum leidt tot een klompje mesotheelcellen zogenaamde proepicardium 1-4. Cellen uit de proepicardium dan migreren en de envelop van de hartspier die het epicard. Vervolgens een subset van epicardiale cellen ondergaan EMT waardoor een trekkende populatie van epicard afgeleide cellen (EPDCs) dat vervolgens de hartspier binnendringen. Genetische en retrovirale lineage tracing experimenten hebben aangetoond dat EPDCs differentiëren in diverse lineages, waaronder gladde spiercellen, fibroblasten, endotheelcellen en cardiomyocyten (indien aanwezig). Daarom aanzienlijk EPDCs bijdragen aan de ontwikkeling van de coronaire vaatstelsel en myocard architectuur 1,2,4-9. Bovendien is het epicard is essentieel voor de ontwikkeling van ventriculaire compacte laag 10-12. voor example Gittenberger-de Groot et al. aangetoond dat remming van de uitgroei van de proepicardium leidt tot een scala aan defecten zoals een dunne myocardium deficiënte lussen van het hart en abnormale vorming interventriculair septum en daardoor embryonale letaliteit 13. Paracriene factoren uitgescheiden door de embryonale epicard moduleren cardiomyocyt proliferatie en differentiatie. Consistent hiermee epicard-specifieke deletie van signaaltransductiewegen zoals retinoïnezuur (RA), fibroblast groeifactoren (FGF's) en Wnt / β-catenine resulteerde in defecte myocardiale groei en embryonale letaliteit 14-16.
Hoewel de epicard werd geloofd rustig bij volwassen harten te zijn, hebben recente studies aangetoond dat de ontwikkelings-programma wordt geactiveerd in de epicard volgende cardiale letsel 17,18. Na activering van de cellen ondergaan snelle proliferatie en EMT die resulteren in EPDC formatie. Deze cellen vertonen de capacity te differentiëren in fibroblasten en gladde spiercellen, maar niet cardiomyocyten of endotheelcellen 18. Bovendien, de EPDCs scheiden pro-angiogene factoren die helpen bij de vascularisatie van de gewonde gebied en dus naar een verbeterde hartfunctie door vermindering van de infarctgrootte. Vanwege deze bevindingen, is het epicard belangstelling voor het onderzoek van hart- en ontwikkeling, ziekte en regeneratie gewonnen.
Transgene technologie heeft een revolutie teweeggebracht in het medisch onderzoek in de 21e eeuw. Met behulp van transgene technologie, zieke muismodellen nabootsen van de menselijke conditie metabolisch en pathofysiologisch zijn met succes ontwikkeld. Echter, het bestuderen van de epicardiale cel gedrag in deze mutanten is een uitdaging vooral te wijten aan de vroege embryonale dodelijkheid geweest. Gezien de belangrijke rol die het speelt in het epicard cardiale ontwikkeling en regeneratie, hebben wij een in vitro kweeksysteem voor muizen epicardia vastgesteldl cellen. Deze methode kan de lange termijn kweek van epicardiale cellen en vergemakkelijkt de gedetailleerde studie van de twee belangrijke eigenschappen van het epicard: het vermogen om te migreren en te differentiëren. De uitgesneden ventrikels van de muis kan worden gekweekt op collageen gels die kunnen worden gebruikt om migratie assays voeren. Wordt gekweekt in een 3D matrix die de collageen-rijke extracellulaire matrix van de subepicardiale laag repliceert beter de in vivo recapituleert celfysiologie. Als alternatief kunnen ze worden gekweekt op objectglaasjes kamer om een epicardiale monolaag die vervolgens kan worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen stellen. Deze monolaag kan worden gebruikt om kleur wordt tight junction eiwitten die inzichten op het vermogen van het epicard met EMT ondergaan die cruciaal is voor migratie bieden. Bovendien differentiatie experimenten kunnen worden uitgevoerd door deze cellen uitgevoerd. Verder kan genexpressieprofiel worden geanalyseerd door het extraheren van RNA uit de cellen enhet uitvoeren van kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). Tenslotte kunnen de monolagen worden behandeld met middelen, gevolgd door moleculaire analyse voor het testen van potentiële therapeutische middelen. In elkaar gezet, dit epicardiale cultuur systeem biedt ons de mogelijkheid om te visualiseren en moleculaire gegevens die ons begrip over epicardiale ontwikkeling bevordert te verzamelen.
Een andere gewenste eigenschap van deze werkwijze is dat het eenvoudig en zonder ingewikkelde installatie vereist. In het kort, worden de embryo's geoogst op E11.5 en E12.5 waarna het hart wordt weggesneden. De ventrikels worden vervolgens gekweekt op hetzij collageengel of kamer dia. Vervolgens kunnen deze cellen worden gebruikt voor stroomafwaartse experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is cruciaal voor technieken die de studie van het epicard vergemakkelijken om aan de toenemende belang van het epicard cardiale ontwikkeling en regeneratie ontwikkelen. De epicardiale teeltsysteem stelt significante voordelen voor epicardiale onderzoek.
Een alternatieve manier om epicardiale cellen te isoleren is om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt. Deze werkwijze berust op het gebruik van epicardiale merkers (of epicardium-celspecifieke transgene expressie van een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van Duke-NUS Graduate Medical School Singapore, Goh fundering en Singapore NRF Fellowship (NRF-NRFF2016-01) naar K. Manvendra Singh.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
References
- Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
- Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
- Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
- Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
- Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
- Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
- Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
- Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms’ tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).
