Cultura in vitro de células epicárdicas De Coração embrionárias de camundongos
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
A riqueza de dados experimentais têm mostrado que o epicárdio influencia passos críticos no desenvolvimento cardíaco. Durante o desenvolvimento, o septo transverso dá origem a um grupo de células mesoteliais conhecidos como o proepicardium 1-4. As células do proepicardium seguida, migrar e envelope do miocárdio formando o epicárdio. Depois disso, um subconjunto de células do epicárdio sofrer EMT dando origem a uma população de células derivadas migratória-epicárdio (EPDCs) que invadem posteriormente o miocárdio. Genética retroviral, bem como a linhagem rastreio experimentos demonstraram que EPDCs diferenciar em linhagens diferentes, incluindo células musculares lisas, fibroblastos, células endoteliais e cardiomiócitos (se qualquer). Portanto EPDCs contribuir significativamente para o desenvolvimento da vasculatura coronária e miocárdica arquitectura 1,2,4-9. Além disso, o epicárdio é essencial para o desenvolvimento da camada compacta do ventrículo 10-12. para example Gittenberger-Groot et ai. demonstraram que a inibição do crescimento do proepicardium leva a uma variedade de defeitos, tais como uma fina miocárdio, looping deficiente do coração e septo interventricular formação anormal e, como resultado, a letalidade embrionária 13. factores parácrinos secretadas a partir do epicárdio embrionário modular a proliferação e diferenciação de cardiomiócitos. Consistente com isto, supressão específica do epicárdio de vias de sinalização, tais como o ácido retinóico (RA), factores de crescimento de fibroblastos (FGF) e Wnt / β-catenina resultou no crescimento do miocárdio com defeito e letalidade embrionária 14-16.
Embora o epicárdio se acreditava ser de repouso em corações adultos, estudos recentes têm mostrado que o programa de desenvolvimento é reativado no epicárdio após lesão cardíaca 17,18. Após a activação, as células sofrem uma rápida proliferação e EMT que resultam na formação EPDC. Estas células exibem a capacitY para se diferenciarem em fibroblastos e células do músculo liso, mas não cardiomiócitos e células endoteliais 18. Além disso, os pró-angiogénico EPDCs segregam factores que ajuda na vascularização da área ferida e, assim, facilitar a melhoria da função cardíaca ao reduzir o tamanho do enfarte. Devido a estes resultados, o epicárdio ganhou interesse no estudo do desenvolvimento cardiovascular, doença e regeneração.
tecnologia transgênica tem revolucionado a investigação médica no século 21. Com o auxílio de tecnologias transgénicos, modelos de ratos doentes que mimetizam a condição humana metabolicamente e fisiopatologicamente ter sido desenvolvida com sucesso. No entanto, o estudo do comportamento das células do epicárdio nestes mutantes tem sido um desafio devido principalmente a letalidade embrionária precoce. Considerando o papel significativo que o epicárdio desempenha no desenvolvimento cardíaco e regeneração, nós estabelecemos um sistema de cultura in vitro para epicardia ratocélulas L. Este método permite que a cultura de longo prazo das células do epicárdio e facilita o estudo detalhado das duas propriedades importantes do epicárdio: a sua capacidade para migrar e diferenciar-se. Os ventrículos cortados do rato poderia ser cultivados em géis de colagénio que podem ser utilizados para conduzir ensaios de migração. Sendo cultivadas em uma matriz 3D que replica a matriz extracelular rica em colágeno da camada subepicárdica recapitula a na fisiologia da célula vivo melhor. Alternativamente, eles podem ser cultivadas em lâminas de câmara, a fim de estabelecer uma monocamada epicárdico que pode então ser utilizado para uma variedade de aplicações a jusante. Esta monocamada pode ser utilizado para corar para proteínas de junções apertadas, que irá proporcionar conhecimentos sobre a capacidade do epicárdio se submeter EMT que é crucial para a migração. Além disso, as experiências de diferenciação pode também ser levada a cabo sobre estas células. Além disso, o perfil de expressão do gene pode ser analisado através da extracção de ARN a partir das células erealização da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Por último, as monocamadas também poderiam ser tratados com agentes seguido por uma análise molecular para testar potenciais agentes terapêuticos. Juntos, este sistema de cultura epicárdica nos proporciona a oportunidade de visualizar e reunir dados molecular que possibilita a compreensão sobre o desenvolvimento do epicárdio.
Outra característica desejável deste método é que é simples e não é necessária configuração elaborada. Em resumo, os embriões são colhidos em E11.5 E12.5 ou após o que o coração é excisado. Os ventrículos são então cultivadas em qualquer um gel de colagénio ou lâminas de câmara. Subsequentemente, estas células podem ser usadas para conduzir experiências jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
É crucial para desenvolver técnicas que facilitam o estudo do epicárdio para atender à crescente importância do epicárdio no desenvolvimento cardíaco e regeneração. O sistema de cultura do epicárdio representa vantagens significativas para a investigação do epicárdio.
Um modo alternativo para isolar as células do epicárdio é a utilização de triagem de células activadas por fluorescência (FACS). Este método baseia-se na utilização de marcadores do epicárdio (ou express…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos de Duke-NUS Graduate Medical School Singapura, Goh fundação e Singapura NRF comunhão (NRF-NRFF2016-01) para Manvendra K. Singh.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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