Экстракорпоральное культуры эпикардиального клеток из эмбриональных сердца
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
Богатство экспериментальных данных показано, что Эпикард влияет на критические шаги в развитии сердца. В процессе разработки, перегородку transversum приводит к глыбе мезотелиальной клеток , известных как proepicardium 1-4. Клетки из proepicardium затем мигрируют и конверт миокард, образующий эпикарда. Вслед за этим подмножеством эпикарда клетки подвергаются ЕМТ порождая миграционным популяции эпикарда клеток, полученных (EPDCs), которые впоследствии проникают в миокард. Генетический а также ретровирусный родословная отслеживании эксперименты показали, что EPDCs дифференцироваться в различные клоны, включая гладкомышечные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки и кардиомиоциты (если таковые имеются). Поэтому EPDCs вносят значительный вклад в развитие коронарных сосудов и миокарда архитектуры 1,2,4-9. Кроме того, эпикарда имеет важное значение для развития желудочковой компактного слоя 10-12. При еXample Gittenberger-де Грут и др. показали , что ингибирование вырост proepicardium приводит к массиву дефектов , таких как тонкий миокарда, дефицитной зацикливание сердца и аномальному образованию межжелудочковой перегородки и в результате, к эмбриональной летальности 13. ПАРАКРИННОЙ факторы, секретируемые из эмбрионального эпикарда модулировать пролиферацию кардиомиоцитов и дифференцировки. В соответствии с этим, эпикарда конкретных удаление сигнальных путей , таких как ретиноевая кислота (RA), факторы роста фибробластов (ФРФ) и Wnt / -катенина привело к дефектной роста миокарда и эмбриональной летальности 14-16.
Хотя эпикарда , как полагают, в состоянии покоя у взрослых сердец, недавние исследования показали , что программа развития будет возобновлена в эпикарда после остановки травмы 17,18. После активации клетки подвергаются быстрой пролиферации и EMT, которые приводят к образованию EPDC. Эти клетки демонстрируют CapacitY дифференцироваться в фибробластах и клетках гладкой мускулатуры , но не кардиомиоцитов или эндотелиальных клеток 18. Кроме того, EPDCs секретируют проангиогенные факторы, которые помогают в васкуляризации поврежденной области и тем самым облегчают улучшенную функцию сердца за счет уменьшения размера инфаркта. Из-за этих выводов Эпикард приобрел интерес к изучению сердечно-сосудистых заболеваний, развития и регенерации.
Трансгенные технологии произвели революцию медицинских исследований в 21-м веке. С помощью трансгенных технологий, заболевшие мышиные модели, имитирующие человеческое состояние метаболически и патофизиологически были успешно разработаны. Однако, изучая эпикарда поведение клеток в этих мутантов было проблемой, главным образом из-за ранней эмбриональной летальности. Учитывая значительную роль , которую играет в эпикарда сердца развития и регенерации, мы создали систему культивирования в пробирке для epicardia мышил клетки. Этот метод позволяет долгосрочную культуру эпикарда клеток и облегчает детальное изучение двух важных свойств эпикарда: его способность мигрировать и дифференцироваться. Исключены желудочки от мыши могли быть культивированы на коллагеновые гели, которые могут быть использованы для проведения анализов миграции. Культивируются в 3D – матрицу , которая повторяет коллаген богатых внеклеточного матрицу субэпикардиального слоя лучше повторяет в естественных условиях физиологии клетки. В качестве альтернативы они могут быть культивированы на камерные слайды в целях создания эпикарда монослой, который затем может быть использован для различных последующих применений. Этот монослой может быть использован для окрашивания для плотных соединений белков, которые будут обеспечивать представление о способности эпикарда претерпевать EMT что имеет решающее значение для миграции. Кроме того, эксперименты дифференцировки также могут быть выполнены на этих клетках. Кроме того, профиль экспрессии генов может быть проанализирован путем экстракции РНК из клеток ивыполняя количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). И, наконец, монослои также можно лечить с агентами, за которыми следует молекулярный анализ, чтобы проверить на потенциальных терапевтических средств. Соединенный, эта система эпикардиальная культура дает нам возможность визуализировать и собирать молекулярные данные, которые наше понимание улучшить систему о эпикардиального развития.
Другим желательным признаком этого способа заключается в том, что он прост и не требует дополнительных настроек. Вкратце, зародыши собирают на E11.5 или E12.5, после чего вырезают сердце. Желудочки затем культивировали на любом коллагеновым гелем или камерные слайды. Затем эти клетки могут быть использованы для проведения экспериментов ниже по течению.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это имеет решающее значение для разработки методов, которые облегчают изучение эпикарда для удовлетворения растущего значения эпикарда сердечного развития и регенерации. Система эпикардиальная культуры создает значительные преимущества для эпикардиального исследований.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана за счет средств DUKE-НУК Высшей медицинской школы Сингапура, Goh фонда и Сингапур NRF общения (NRF-NRFF2016-01) до Manvendra К. Сингх.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
References
- Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
- Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
- Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
- Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
- Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
- Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
- Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
- Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms’ tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).
