Cultivo in vitro de células a partir de epicárdicos del corazón de embriones de ratón
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
Una gran cantidad de datos experimentales han puesto de manifiesto que el epicardio influye en los pasos críticos en el desarrollo cardíaco. Durante el desarrollo, el tabique transverso da lugar a un grupo de células mesoteliales conocidos como proepicardio 1-4. Las células de la proepicardio luego migran y el sobre el miocardio que forma el epicardio. Después de esto, un subconjunto de células epicárdicas someterse a aumento EMT dando a una población migratorio de las células derivadas del epicardio se (EPDCs) que posteriormente invaden el miocardio. linaje genético, así como el rastreo retroviral experimentos han demostrado que EPDCs diferenciarse en varios linajes, incluyendo células de músculo liso, fibroblastos, células endoteliales y cardiomiocitos (si los hay). Por lo tanto EPDCs contribuyen significativamente al desarrollo de la vasculatura coronaria y la arquitectura miocárdica 1,2,4-9. Además, el epicardio es esencial para el desarrollo de la capa compacta ventricular 10-12. Delanteroxample Gittenberger-de Groot et al. demostró que la inhibición de la excrecencia de la proepicardio conduce a una serie de defectos, tales como el miocardio delgada, looping deficiente del corazón y la formación de septum interventricular anormal y, como resultado, la letalidad embrionaria 13. factores paracrinos secretadas desde el epicardio embrionario modular la proliferación de los cardiomiocitos y la diferenciación. En consonancia con esto, la deleción-epicardio específica de las vías de señalización tales como el ácido retinoico (RA), factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) y Wnt / β-catenina resultó en el crecimiento del miocardio defectuoso y letalidad embrionaria 14-16.
Aunque el epicardio se creía que era quiescente en corazones adultos, estudios recientes han demostrado que el programa de desarrollo se reactiva en el epicardio después de una lesión cardiaca 17,18. Tras la activación, las células se someten a una rápida proliferación y EMT que dan lugar a la formación de EPDC. Estas células exhiben el capacity de diferenciarse en fibroblastos y células musculares lisas pero no cardiomiocitos o células endoteliales 18. Además, los EPDCs secretan factores proangiogénicos que ayudan en la vascularización de la zona lesionada y así facilitar la mejora de la función cardíaca mediante la reducción del tamaño del infarto. Debido a estos resultados, el epicardio ha ganado interés en el estudio del desarrollo cardiovascular, la enfermedad y la regeneración.
La tecnología transgénica ha revolucionado la investigación médica en el siglo 21. Con la ayuda de tecnologías transgénicas, los modelos de ratón enfermas que imitan la condición humana metabólicamente y fisiopatológico se han desarrollado con éxito. Sin embargo, el estudio del comportamiento de células epicárdica en estos mutantes ha sido un reto debido principalmente a la letalidad embrionaria temprana. Teniendo en cuenta el importante papel que juega el epicardio en el desarrollo y la regeneración cardiaca, hemos establecido un sistema de cultivo in vitro para ratón epicardiacélulas L. Este método permite que el cultivo a largo plazo de las células epicárdicas y facilita el estudio detallado de las dos propiedades importantes del epicardio: su capacidad de migrar y diferenciarse. Los ventrículos escindió del ratón podrían ser cultivadas en geles de colágeno que pueden ser utilizados para llevar a cabo los ensayos de migración. De haber sido cultivadas en una matriz 3D que reproduce la matriz extracelular rica en colágeno de la capa subepicárdica mejor recapitula la fisiología celular in vivo. Alternativamente, pueden ser cultivadas en portaobjetos de cámara con el fin de establecer una monocapa epicárdica que luego se puede utilizar para una variedad de aplicaciones aguas abajo. Esta monocapa se puede utilizar para teñir para proteínas de unión estrecha que proporcionará información sobre la capacidad del epicardio a someterse a EMT que es crucial para la migración. Además, los experimentos de diferenciación también pueden llevarse a cabo en estas células. Además, el perfil de expresión génica se puede analizar mediante la extracción de ARN de las células yla realización de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Por último, las monocapas también podrían ser tratados con agentes, seguido de un análisis molecular para probar posibles terapias. En conjunto, este sistema de cultivo epicárdica nos proporciona la oportunidad de visualizar y obtener datos molecular que promueve nuestro entendimiento sobre el desarrollo del epicardio.
Otra característica deseable de este método es que es sencilla y no se requiere ninguna configuración compleja. En resumen, los embriones se recogieron a E11.5 E12.5 o después de lo cual se extirpó el corazón. Los ventrículos se cultivan a continuación en cualquiera de gel de colágeno o la cámara de diapositivas. Posteriormente, estas células se pueden utilizar para llevar a cabo experimentos de aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es fundamental para el desarrollo de técnicas que facilitan el estudio del epicardio para atender a la creciente importancia del epicardio en el desarrollo cardiaco y la regeneración. El sistema de cultivo epicárdica plantea ventajas significativas para la investigación epicárdica.
Una forma alternativa para aislar las células epicárdicas es utilizar la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Este método se basa en el uso de marcadores epicárdicas (o expresió…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de Duke-NUS Graduate Escuela de Medicina de Singapur, Goh fundación y comunión Singapur NRF (NRF-NRFF2016-01) para Manvendra K. Singh.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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