마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
실험 데이터의 재산은 심장 외막은 심장 개발에 중요한 단계에 영향을 미치는 것을 설명했다. 개발하는 동안, 격벽 transversum는 proepicardium 1-4라고도 중피 세포 덩어리를 일으킨다. proepicardium의 세포는 마이그레이션 및 심장 외막을 형성 심근 봉투. 이 후, 심 외막 세포의 일부는 이후 심근을 침범 심장 외막 유래 세포 (EPDCs)의 철새 인구 EMT주는 상승을 받다. 실험 추적 유전자뿐만 아니라 레트로 바이러스 계보 EPDCs가 평활근 세포, 섬유 아세포, 내피 세포 및 심근 (있는 경우)를 포함한 다양한 계통으로 분화 것을 증명했다. 따라서 EPDCs는 관상 동맥 혈관과 심근 아키텍처 1,2,4-9의 발전에 크게 기여하고 있습니다. 또한, 상기 외막은 심실 컴팩트 10-12 층의 개발이 필수적이다. 전자의 경우xample Gittenberger – 드 그루 등. proepicardium의 생장을 억제하는 등의 얇은 심근, 심장과 비정상적인 심실 중격 형성의 부족 루프로 그 결과, 배아 치사 (13) 결함의 배열에 이르게 것을 보여 주었다. 배아 심장 외막에서 분비 분비 인자는 심근 세포의 증식과 분화를 조절한다. 이과 일치, 같은 레티노 산 (RA), 섬유 아세포 성장 인자 (FGFs)과의 Wnt / β-catenin이 같은 신호 전달 경로의 심장 외막 특정 삭제에 결함이 심근 성장과 배아 치사 14-16의 결과.
심장 외막이 성인의 마음에 대기 것으로 생각되었지만, 최근의 연구는 발달 프로그램은 심장 부상 17, 18 다음 심장 외막에 활성화되는 것으로 나타났습니다. 활성화되면, 세포 EPDC 형성 될 급속한 증식과 EMT를 겪는다. 이러한 세포는 capacit 전시Y는 섬유 아세포 및 평활근 세포가 아니라 심근 세포 또는 혈관 내피 세포 (18)로 분화한다. 또한 EPDCs는 손상된 영역의 혈관에서 지원하므로이 경색 크기를 감소시킴으로써 개선 된 심장 기능을 촉진한다는 proangiogenic 인자를 분비한다. 때문에 이러한 결과로, 심장 외막은 심장 혈관 개발, 질병 및 재생 연구에 대한 관심을 얻고있다.
형질 전환 기술은 21 세기 의학 연구에 혁명을했다. 형질 전환 기술의 도움으로 대사 및 pathophysiologically 인간 조건을 모방 질환 마우스 모델이 성공적으로 개발되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 체의 심 외막 세포의 행동을 연구하는 것은 초기 배아 치사에 주로 도전하고있다. 심장 외막은 심장 개발 및 재생에서 활약하는 중요한 역할을 고려할 때, 우리는 마우스 epicardia에 대한 체외 배양 시스템을 확립리터 세포. 이 방법은 심 외막 세포의 장기 배양이 가능하고 외막의 두 가지 중요한 특성의 상세한 연구를 용이하게한다 : 이동 및 분화하는 능력. 마우스에서 적출 심실은 마이그레이션 분석을 수행하는 데 사용할 수있는 콜라겐 겔상에서 배양 될 수있다. 더 subepicardial 층의 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질을 복제하는 생체 세포 생리학을 되풀이되었습니다 차원 매트릭스에서 배양된다. 대안들은 다음 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 외막 단층을 설정하기 위해 챔버 슬라이드상에서 배양 될 수있다. 이 단분자막은 마이그레이션 중요 EMT를 받아야하는 심장 외막의 능력에 대한 통찰력을 제공한다 꽉 접합 단백질 염색하기 위해 사용될 수있다. 또한, 분화 실험은 이러한 세포상에서 수행 될 수있다. 또한, 유전자 발현 프로파일을 세포로부터 RNA를 추출하여 분석 할 수 있고,정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)을 수행. 마지막으로, 단일 층은 잠재적 인 치료제를 테스트하는 분자 분석 하였다 제로 처리 될 수있다. 함께 넣어,이 심 외막 문화 시스템은 시각화 및 심 외막 개발에 대한 우리의 이해를 발전한다 분자 데이터를 수집 할 수있는 기회를 우리에게 제공한다.
이 방법의 또 다른 바람직한 특징은 간단하고 더 복잡한 설정이 필요하지 않다는 것이다. 간단히, 배아는 심장이 절제되어 E11.5 또는 E12.5 다음에 수확된다. 심실은 콜라겐 젤 또는 챔버 슬라이드 중 하나에 배양. 이어서, 이들 세포는 하류 실험을 수행 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심장 개발과 재생의 심장 외막의 증가 중요성에 부응하기 위해 심장 외막의 연구를 촉진 기술을 개발하는 것이 중요한 것입니다. 심 외막 문화 시스템은 심 외막 연구에 상당한 이점을 포즈.
심 외막 세포를 분리하는 다른 방법은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 것이다. 이 방법은, 다른 계통에서 외막 세포를 분리하는 외막 마커 (또는 형광 단백질의 심장 외막 세포 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DUKE-NUS 대학원 의과 대학 싱가포르, Manvendra K. 싱에 총리 재단, 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-NRFF2016-01)에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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