マウス胚心臓から心外膜細胞の体外培養で
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
実験データの富は、心外膜は、心臓の開発における重要なステップに影響を与えることが示されています。開発中に、横中隔はproepicardium 1-4として知られている中皮細胞の塊を生じさせます。 proepicardiumからの細胞は、次に移動して、心外膜を形成する心筋を包みます。これに続いて、心外膜細胞のサブセットは、その後、心筋に侵入心外膜由来細胞（EPDCs）の遊走集団を生じるEMTを起こします。実験トレース遺伝子、ならびにレトロウイルス系統はEPDCsは、平滑筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞および心筋細胞（もしあれば）を含む種々の系統に分化することを実証しました。したがってEPDCsは、冠血管系および心筋アーキテクチャ1,2,4-9の発展に大きく貢献しています。さらに、心外膜は、心室緻密層10-12の発展のために不可欠です。 EのXAMPLE Gittenbergerドはグルートら proepicardiumの伸長を阻害することが、このような薄い心筋、心臓や異常心室中隔形成の欠損ループとして、その結果、胚致死13等の欠陥の配列につながることを実証しました。胚性心外膜から分泌パラクリン要因は、心筋細胞の増殖および分化を調節します。これと一致して、レチノイン酸（RA）、線維芽細胞増殖因子（FGF）およびWnt /βカテニンシグナル伝達経路などの心外膜特異的欠失は、欠陥のある心筋の増殖および胚致死14-16もたらしました。
心外膜は、大人の心の中に静止状態であると考えられていたが、最近の研究では、発達プログラムが心外傷17,18以下の心外膜に再活性化されることが示されています。活性化されると、細胞はEPDCの形成をもたらす急速な増殖およびEMTを起こします。これらの細胞は、capacitを示しますyは、線維芽細胞や平滑筋細胞ではなく、心筋細胞または内皮細胞18に分化します。また、EPDCsは、損傷部位の血管新生を助ける、したがって梗塞サイズを減少させることにより改善された心機能を促進する血管新生促進因子を分泌します。これらの知見に、心外膜は、心血管の開発、病気と再生の研究に関心を集めています。
トランスジェニック技術は、21世紀の医学研究に革命をもたらしました。トランスジェニック技術の助けを借りて、代謝および病態生理学的に人間の条件を模倣する病気のマウスモデルが正常に開発されています。しかし、これらの変異体における心外膜細胞の挙動を研究すると、初期胚致死性が主な原因課題でした。心外膜は、心臓の開発と再生に果たしていることが重要な役割を考えると、我々は、マウスの噴門上部のためのin vitro培養系を確立していますL細胞。この方法は、心外膜細胞の長期培養を可能にし、心外膜の二つの重要な特性の詳細な検討が容易：移行と分化する能力を。マウスから切除した心室は、遊走アッセイを実施するために使用することができるコラーゲンゲル上で培養することができます。より良い心外膜下の層のコラーゲンが豊富な細胞外マトリックスを複製インビボの細胞生理学を再現する3Dマトリックスで培養されています。あるいは、それらは、次いで、下流の適用の種々のために使用することができる心外膜単層を確立するために、チャンバースライド上で培養することができます。この単分子膜は、移行のために重要であるEMTを受ける心外膜の能力に関する洞察を提供するタイトジャンクションタンパク質を染色するために使用することができます。また、分化実験は、これらの細胞上で行うことができます。さらに、遺伝子発現プロファイルは、細胞からRNAを抽出することによって分析することができると定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を行います。最後に、単層はまた、潜在的な治療薬をテストするために、分子分析を行っ剤を用いて治療することができます。まとめると、この心外膜培養系は、視覚化し、心外膜の開発についての我々の理解をfurthers分子データを収集する機会を提供してくれます。
この方法の別の望ましい特徴は、それが簡単であり、いかなる精巧なセットアップを必要としないことです。簡単に言えば、胚は、心臓を摘出されたE11.5またはE12.5以下で収穫されています。心室はその後、コラーゲンゲルまたはチャンバースライドのいずれかで培養されます。その後、これらの細胞は、下流の実験を行うために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
心臓の開発と再生に心外膜の重要性が増しに応えるために心外膜の研究を容易にする技術を開発することが極めて重要です。心外膜培養系は、心外膜の研究のための重要な利点をもたらします。
心外膜細胞を単離する別の方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用することです。この方法は、他の系統から心外膜細胞を分離するための心外膜マーカー（または蛍光タン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DUKE-NUS大学院医学部シンガポール、Manvendra K.シンへゴー基盤とシンガポールNRFの交わり（NRF-NRFF2016-01）からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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