דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
גידולים ממאירים במוח הנפוצים ביותר תוך גולגולתי העיקריים הם כיתה III astrocytomas ו multiforme גליובלסטומה IV כיתה (גליובלסטומה או GBM). גידולים אלה מציעים בפרוגנוזה גרועה עם הישרדות לשנה אחת החציוני בין 12 – 15 חודשים עם טיפולים הקיימים כיום עבור GBM בארה"ב 1-3. טיפולי Multimodality כוללים ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה כולל temozolomide (TMZ) וסוכנים במיקוד קינאז. איתות קינאז הוא dysregulated תדיר GBM, כולל תת קבוצות של גידולים עם הגברה או מוטציות הפעלת ב הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), עליות טסיות נגזר הקולטן לגורם הצמיחה (PDGFR) איתות, גדל Phosphatidyl-אינוזיטול-3 kinase (PI3K) ו הגידול בתמיכה איתות angiogenic דרך הקולטן לגורם הצמיחה דם האנדותל (VEGFR) וכן 4-6 מסלולים מונע קינאז אחרים. נוכחי במבחנה במודלים vivo לעתים קרובות לאבד שינויים נציג אלה <sup> 7. בנוסף, פרופיל גנטי לא הציע את היתרונות הצפויים בן כדי לשקף את העובדה ששינויים גנטיים אפיגנטיים לא תמיד לחזות שינויים ברמת פעילות חלבון, שבו רוב קינאז מיקוד סוכנים לפעול ישירות, והיכן טיפולים עם מנגנונים אחרים של פעולה רשאית לפעול בַּעֲקִיפִין.
שורת התא המסורתית הנציחה שניתן passaged אינסוף כבר זמן רב את הסטנדרט עבור בדיקות סמים בשל קלות תחזוקת שחזור שלהם. עם זאת, מודל זה סובל תזונתי גבוה (ומלאכותי) בסביבת גידול בוחרת עבור גדל מהר תאים שונים מאוד מן הגידול המקורי. ככזה, חלה התעניינות רבה בפיתוח מערכות מודל מציאותי יותר המשקפים מערכת ביולוגית הגידול מורכב יותר, כפי שוהה המטופל. xenografts גידול שפותח ישירות גידול ראשוני גדל בעכברים ( "xenoline," xenograft נגזרות החולות או PDX) proviדה מערכת מודל רעיונית יותר, במיוחד במקרים של בריפוי הסרטן, כפי שהם מורגשים יותר לנבא הצלחה קלינית. 8 למרות הביולוגיה שמשקפת בצורה טובה יותר, המודלים האלה הם יקרים קשים להקים ולתחזק. יתר על כן, הם לא מקובל מחקרי תפוקה גבוהה. הצורך טוב יותר לפתח מודלים ביולוגיים שיותר לשקף במדויק שינויים מולקולריים גידולים ראשוניים, ו לפרופיל ולבדוק מודלים אלה באמצעות מדדים ישירים פעילות קינאז, לא פונדקאית סמנים גנטיים, ברור.
היא מוכרת היטב שבניגוד דו ממדי תרבויות monolayer (2D), 3D או מודלי assay רבים-תאיים יכול לספק יותר פיסיולוגי נקודות קצה רלוונטיות 9-11. תרבות 3D נפוצה גישות לערב microcarriers מטריקס מצופה היווצרות אליפטית תא. spheroids הגידול יכול להיות שנוצר באמצעות צבירה הסלולר באמצעות בקבוק טווה, צלחת pHEMA ותליית טכניקות טיפה. מגבלות עבור tגישות hese כוללות: חוסר יכולת של תאים מסוימים כדי ליצור spheroids יציב, השתנות בצמיחה ואתגרים עם סוגי תאים מעורבים. לחלופין, סינתטיים רבים (הידרוג'ל, פולימר) ובעלי חיים הנגזרות Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) מטריקס מן סרקומות העכבר, קולגן שור) מטריצות פותחו לתרבות 3D לומד 12-14. מטריקס עכבר EHS נעשה שימוש נרחב אך ידוע להאיץ גדילת תאים והתמיינות במבחנה ובחי 15.
על מנת לשכפל ביולוגית גידול 3D, מערכת biomatrix אדם פותחה על ידי ד"ר ראג 'סינג et al. 16. Biogel האנושית טבעית, הצמיחה ללא הגורם מאפשרת פיגומי תרבות 3D (חרוזים, דיסקים), אשר תומכים טיפוח לטווח ארוך של סוגי תאים מרובים. סדרת עיצובי תרבות biogel האנושי 3D מוקמת ללימוד צמיחת גידול, הדבקה, תכונות אנגיוגנזה ופלישה. יתרונות ומאפיינים של biogel האדם לעומת משותף ג'לים העכבר EHS מסוכמים בטבלה 1 ולוח 2.
| מָקוֹר: | האדם Amnions (רקמת Pooled) הפתוגן- חינם, IRB-פטור / אושרה |
| טבע ECM: | ללא מפוגל Biogel (הפקת GLP) |
| מַפְתֵחַ רכיבים: | Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin & HSPG (<3%) |
| GF-חינם: | לגילוי EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenic, אינו רעיל) |
טבלה 1: מאפיינים של האדם Biogel לעומת ג'לים נפוצות EHS.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wiה-next.within-page = "תמיד">טבלה 2: יתרונות של האדם Biogel לעומת ג'לי הנפוצים EHS.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול בעיקר מתייחסים microtumor הדור, כמו גם מינון תרופה ותחזוקה. מכיוון חרוזי microtumor הם שבירים יכולים להיקרע בקלות, בזהירות רבה נחוצה הוא בשלבי ההתפתחות של assay ותחזוקה. אם מתרחשת שגיאה במהלך אחד מהתהליכים אלה, אפשר להתפשר פרשנות ניסיון, גרימת רחבה א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי מענק R21 NIH (PI: ג Willey, CA185712-01), בפרס נבג גידול במוח (PD: GY גילספי, P20CA 151,129-03) וחוזה SBIR (PI: ר 'סינג, N43CO-2,013-00,026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
