Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
Os tumores cerebrais primários mais comuns intracranianas malignos são astrocitomas grau III e grau IV glioblastoma multiforme (glioblastoma ou GBM). Estes tumores oferecer prognósticos pobres com sobrevida de um ano médio entre 12 – 15 meses, com terapias atuais para GBM no 1-3 EUA. multimodalidade terapias incluem cirurgia, radiação, e quimioterapia, incluindo temozolomida (TMZ) e agentes alvo-quinase. sinalização cinase é frequentemente desreguladas na MBG, incluindo subconjuntos de tumores com amplificação ou mutações de activação do Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR), os aumentos no Crescimento Derivado de Plaquetas do Receptor do Factor (PDGFR) de sinalização, o aumento da fosfatidil-inositol-3-quinase (PI3K) e tumor angiogénico apoio sinalização através do factor de Crescimento endotelial Vascular receptor (VEGFR), bem como outras vias de cinase orientada 4-6. Current in vitro e em modelos in vivo freqüentemente perdem estas alterações representativos <sup> 7. Além disso, a caracterização genética não ofereceu os benefícios esperados que podem refletir o fato de que as alterações genéticas e epigenéticas nem sempre prever as mudanças no nível de atividade da proteína, onde a maioria das quinase agentes visando atuar diretamente, e onde terapias com outros mecanismos de ação pode agir indiretamente.
A linha de células imortalizadas tradicional que pode ser várias passagens ad infinitum tem sido o padrão para testes de drogas devido à sua facilidade de manutenção e reprodutibilidade. No entanto, este modelo sofre de um ambiente de crescimento alta de nutrientes (e artificial) que seleciona para as células que diferem muito do tumor original crescendo rapidamente. Como tal, tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de sistemas modelo mais realistas que reflectem um sistema biológico do tumor mais complexo como está presente no paciente. xenoenxertos de tumor desenvolvido directamente a partir de um tumor primário crescido em ratos ( "xenoline," xenoenxerto derivado do paciente ou PDX) provide um sistema modelo mais reflexivo, particularmente no contexto de cancro terapêutica, como eles são sentidos para prever de forma mais confiável de sucesso clínico. 8 Apesar da biologia mais reflexivo, esses modelos são caros e são difíceis de estabelecer e manter. Além disso, eles não são passíveis de estudos de alta produtividade. A necessidade de melhor desenvolver modelos biológicos que refletem com mais precisão as alterações moleculares nos tumores primários, e ao perfil e testar esses modelos utilizando medidas diretas de atividade quinase, não substituto marcadores genéticos, é claro.
É bem reconhecido que ao contrário de duas dimensões (2D) culturas em monocamada, 3D ou modelos de ensaio multicelulares pode fornecer mais fisiologicamente relevantes terminais 9-11. cultura 3D abordagens comuns envolvem microve�ulos revestido de matriz e formação esferóide celular. esferóides de tumor pode ser gerado através da agregação celular utilizando balão giratório, placa pHEMA e pendurando técnicas de gota. Limitações para tabordagens stas incluem: incapacidade de algumas células para formar esferóides estáveis, a variabilidade no crescimento e desafios com mistura de tipos celulares. Em alternativa, muitos sintético (hidrogel, polímero) e animal derivada de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de rato, o colagénio de bovino) matrizes têm sido desenvolvidos para a cultura 3D estuda 12-14. Matriz de rato EHS é extensivamente utilizado, mas conhecido para promover o crescimento e a diferenciação celular in vitro e in vivo 15.
A fim de replicar a biologia do tumor 3D, um sistema de biomatriz humano foi desenvolvido pelo Dr. Raj Singh et ai. 16. O biogel humana livre de fator natural, permite o crescimento de cultura de andaimes 3D (esferas, discos), que suportam o cultivo de longo prazo de vários tipos de células. Uma série de projetos 3D cultura Biogel humana são estabelecidos para estudar o crescimento do tumor, aderência, angiogênese e invasão propriedades. Vantagens e propriedades de Biogel humano quando comparado com comumgéis EHS rato estão resumidas na Tabela 1 e Tabela 2.
| Fonte: | Âmnions Humano (tecido em pool) livre de patógenos, o IRB-exempt / aprovado |
| Natureza ECM: | Não desnaturada Biogel (GLP-produção) |
| Chave componentes: | Col-I (38%), a laminina (22%), Cl-IV (20%), COL-III (7%), entactina HSPG & (<3%) |
| -GF livre: | Indetectável EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogênico, não-tóxico) |
Tabela 1: Propriedades de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = "always">Tabela 2: Vantagens de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas críticas no âmbito do protocolo predominantemente relacionados com microtumor geração, bem como a administração de drogas e de manutenção. Porque as contas microtumor são frágeis e facilmente rasgado, extremo cuidado é necessário em ambas as fases de desenvolvimento de um ensaio e manutenção. Se ocorrer um erro durante qualquer um destes processos, a interpretação experimental pode ser comprometida, causando extensão ou repetição desnecessária dos experimentos ou mesmo exclusão de dados. <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Suportado pelo NIH conceder R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), prêmio Tumor SPORE Brain (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) e contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00.026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
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