Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
I intracraniche tumori cerebrali maligni primitivi più comuni sono grado astrocitomi III e IV grado glioblastoma multiforme (glioblastoma o GBM). Questi tumori offrono prognosi poveri con mediana di sopravvivenza di un anno tra i 12 – 15 mesi con le terapie correnti per GBM negli Stati Uniti 1-3. terapie multimodalità comprendono la chirurgia, radioterapia e chemioterapia compresa temozolomide (TMZ) e gli agenti chinasi mirati. segnalazione della chinasi è spesso dysregulated in GBM, tra sottogruppi di tumori con amplificazione o mutazioni attivanti nel Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), aumenti di Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) di segnalazione, una maggiore fosfatidil-inositolo-3-chinasi (PI3K) e tumore sostenere segnalazione angiogenico attraverso Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR), così come altre chinasi guidato percorsi 4-6. Attuale in vitro e in vivo perdono spesso queste alterazioni rappresentativi <sup> 7. Inoltre, profilo genetico non ha offerto i benefici attesi che può riflettere il fatto che i cambiamenti genetici ed epigenetici non sempre prevedere i cambiamenti a livello di attività della proteina, dove la maggior parte chinasi agenti di targeting agiscono direttamente, e dove le terapie con altri meccanismi d'azione possono agire indirettamente.
La linea tradizionale di cellule immortalato che possono essere diversi passaggi all'infinito è stata a lungo lo standard per test anti-droga a causa della loro facilità di manutenzione e riproducibilità. Tuttavia, questo modello soffre di un ambiente di crescita elevato di nutrienti (e artificiale) che seleziona per le cellule che si differenziano notevolmente dal tumore originale in rapida crescita. Come tale, c'è stato un considerevole interesse nello sviluppo di sistemi modello più realistici che riflettono un sistema biologico tumore più complessa in quanto è presente nel paziente. xenotrapianti tumorali sviluppato direttamente da un tumore primario cresciuto in topi ( "xenoline," xenotrapianto paziente-derivati o PDX) Provide un sistema modello più riflessivo, in particolare nel contesto di terapie del cancro, come si sentono di prevedere in modo più affidabile successo clinico. 8 Nonostante la biologia più riflessivo, questi modelli sono costosi e sono difficili da stabilire e mantenere. Inoltre, non sono suscettibili di studi ad alto rendimento. La necessità di sviluppare meglio i modelli biologici che riflettono più accuratamente alterazioni molecolari dei tumori primari, e al profilo e testare questi modelli con misure dirette di attività chinasi, non surrogare marcatori genetici, è chiaro.
E 'ben noto che a differenza di due-dimensionali (2D) colture monostrato, modelli di analisi multicellulari 3D o in grado di fornire più fisiologicamente rilevanti endpoint 9-11. cultura 3D comune si avvicina coinvolgere microcarriers matrice rivestite e la formazione sferoide cellulare. sferoidi tumorali possono essere generati tramite l'aggregazione cellulare utilizzando pallone filatore, piatto pHEMA e appendere le tecniche di caduta. Limitazioni per tapprocci ueste includono: impossibilità per alcune cellule a formare sferoidi stabili, la variabilità in termini di crescita e le sfide con tipi di cellule miste. In alternativa, molti sintetico (idrogel, polimeri) e di derivazione animale Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) a matrice da sarcomi del mouse, collagene bovino) matrici sono stati sviluppati per la cultura 3D studia 12-14. Matrix mouse EHS è ampiamente utilizzato, ma noto per promuovere la crescita e differenziazione cellulare in vitro e in vivo 15.
Al fine di replicare biologia tumorale 3D, un sistema biomatrice umano è stato sviluppato dal Dr. Raj Singh et al. 16. Il libero-fattore naturale, la crescita umana Biogel permette impalcature di coltura 3D (sfere, dischi), che supportano la coltivazione a lungo termine di più tipi di cellule. Una serie di disegni cultura Biogel umano 3D sono stabiliti per studiare la crescita del tumore, di adesione, l'angiogenesi e l'invasione proprietà. Vantaggi e proprietà dei Biogel umana rispetto ai comunigel del mouse EHS sono riassunti nella Tabella 1 e Tabella 2.
| Fonte: | Amnions umana (tessuto pool) esenti da organismi patogeni, IRB-esenti / approvato |
| La natura ECM: | Non denaturato Biogel (GLP-produzione) |
| Chiave componenti: | Col-I (38%), laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactina & HSPG (<3%) |
| -GF gratis: | Inosservabile EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (non-angiogenico, non tossico) |
Tabella 1: Proprietà dei Biogel umana rispetto a EHS Gel comuni.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = "always">Tabella 2: Vantaggi di Biogel umana rispetto a EHS Gel comuni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici all'interno del protocollo prevalentemente riguardano microtumor generazione, nonché il dosaggio del farmaco e manutenzione. Poiché le perle microtumor sono fragili e facilmente strappata, estrema cura è necessaria in entrambe le fasi di sviluppo di un test e manutenzione. Se si verifica un errore durante uno di questi processi, l'interpretazione sperimentale può essere compromessa, provocando l'estensione o inutili ripetizioni di esperimenti o addirittura l'esclusione dei dati.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da NIH R21 concessione (PI: C. Willey, CA185712-01), Cervello premio tumore SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129-03) e il contratto SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
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