Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
最も一般的な原発頭蓋内悪性脳腫瘍は、グレードIII星状細胞腫およびグレードIVの多形性膠芽腫 （神経膠芽腫またはGBM）です。米国1-3でGBMに対する現在の治療と15ヶ月-これらの腫瘍は、12の間の中央値1年生存率と予後不良を提供しています。マルチモダリティ療法は、テモゾロミド（TMZ）およびキナーゼを標的とする薬剤を含む外科手術、放射線、および化学療法が含まれます。キナーゼシグナル伝達は、頻繁に上皮成長因子受容体（EGFR）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）の増加、シグナリング、増加したホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）とにおける増幅を有する腫瘍のサブセットまたは活性化変異を含む、GBMで調節不全されます血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、ならびに他のキ ナーゼ駆動経路4-6を介して血管新生シグナル伝達を支援する腫瘍。 in vitroおよびin vivoモデルで現在は頻繁にこれらの代表的な変化を失います<SUP> 7。さらに、遺伝的プロファイリングは、遺伝的およびエピジェネティックな変化は常に標的剤、ほとんどのキナーゼが直接作用するタンパク質活性のレベルで変化を予測せず、他の作用機序を持つ治療法がどこに作用することができるという事実を反映している可能性が予想される利益を提供していません間接的に。
無限に継代することができる伝統的な不死化細胞株は、長いによるメンテナンスや再現が容易に薬物検査のための標準となっています。しかし、このモデルは、高速、元の腫瘍から大きく異なる細胞を増殖させるための選択の高い栄養素（人工）成長環境に苦しんでいます。このように、患者に存在するように、より複雑な腫瘍生物系を反映する、より現実的なモデル系を開発することにかなりの関心が集まっています。腫瘍異種移植片は、マウスで増殖させた原発腫瘍（「xenoline、「患者由来の異種移植片またはPDX）専らから直接開発しますそれらは、より確実に臨床的成功を予測することが8以上の反射生物学にもかかわらず感じられるようにデは、特に癌治療の設定で複数の反射モデル系は、これらのモデルは、高価であり、確立し、維持するのが困難です。さらに、それらは、ハイスループット試験に適していません。より良い、より正確に原発腫瘍の分子変化を反映して、遺伝子マーカーの代理、キナーゼ活性の直接的尺度を使用して、これらのモデルをしないプロファイルおよびテストするために生物学的モデルを開発する必要性が、明らかです。
よく、二次元（2D）単層培養とは異なり、3次元または多分析モデルは、より生理学的に関連するエンドポイント9-11を提供することができることが認識されます。一般的な3D培養手法は、マトリックスコートしたマイクロキャリアおよび細胞スフェロイド形成を伴います。腫瘍スフェロイドは、スピナーフラスコのpHEMA板と懸滴技術を使用して細胞凝集を介して生成することができます。トンの制限事項HESEアプローチは、次のとおりです。安定したスフェロイドを形成するためにいくつかの細胞のための不能、混合細胞型と成長と課題の変動を。あるいは、合成（ハイドロゲル、ポリマー）およびマウス肉腫から動物由来エンゲル・ホルム-スウォーム（EHS）行列多く、ウシコラーゲン）行列は3D培養のために開発されてきた12-14を研究しています。マウスEHSマトリックスは、広く使用されるが、in vitroおよびin vivo 15細胞の増殖および分化を促進することが知られています。
3D腫瘍生物学を複製するためには、人間のバイオマトリックスシステムは、博士のRaj Singh氏らによって開発された。16。 天然の、成長因子を含まないヒトのバイオゲルは、複数の細胞型の長期培養をサポートする3D培養の足場（ビーズ、ディスク）を可能にします。 3Dヒトバイオゲル培養設計のシリーズは、腫瘍増殖、接着、血管新生および浸潤特性を研究するための確立されています。利点と人間のバイオゲルのプロパティ共通に比べて、マウスEHSゲルは、表1および表2にまとめます。
| ソース： | 人間Amnions（プールされた組織） 病原体を含まない、IRB-免除/承認 |
| ECMの性質： | 非変性バイオゲル （GLP-生産） |
| キー コンポーネント： | COL-I（38％）、ラミニン（22％）、COL-IV（20％）、COL-III（7％）、エンタクチンおよびHSPG（<3％） |
| GF-フリー： | 検出不可能 EGF、FGF、TGF、VEGF、PDGF（非血管新生性、非毒性） |
表1：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルのプロパティ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wiTH-next.within-ページ= "常に">表2：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルの利点。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップは、主に世代をmicrotumorに関連するだけでなく、薬剤投与とメンテナンス。 microtumorビーズが壊れやすく、簡単に引き裂かれたので、細心の注意をアッセイおよびメンテナンスの発達段階の両方で必要とされます。エラーがこれらのプロセスのいずれかの間に発生した場合は、実験的な解釈は、拡張機能や実験の不必要な繰り返しやデータのさえ排除を引き起こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
（：C.ウィリー、CA185712-01 PI）、脳腫瘍SPORE賞（PD：GYギレスピー、P20CA 151129から03）とSBIR契約（PI：R.シン、N43CO-2013から00026）NIH R21グラントによってサポートされています。
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
