Генерация Microtumors Использование 3D человека биогель системы культуры и терпеливый происхождения клеток глиобластомы для Kinomic профилирование и тестирования реагирования на наркотики
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
Наиболее распространенные первичные внутричерепные злокачественные опухоли головного мозга III степени астроцитомы и класс IV глиобластома (глиобластома или GBM). Эти опухоли предлагают плохие прогнозы с медианы выживаемости на один год в возрасте от 12 – 15 месяцев с текущей терапии для GBM в США 1-3. Мультимодальности методы лечения включают хирургическое вмешательство, облучение и химиотерапию, включая темозоломида (ТМЗ) и киназы-целевых агентов. сигнализации киназа часто дизрегуляции в GBM, включая подмножества опухолей с усилением или активирующие мутации в Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), увеличение тромбоцитарный фактор роста рецепторов (PDGFR) сигнализации, повышенной Фосфатидил-инозитол-3-киназы (PI3K) и опухоль поддерживая ангиогенный передачу сигнала через сосудистый эндотелиальный фактор роста рецепторов (VEGFR), а также других киназ приводом путей 4-6. Ток в пробирке и в естественных условиях модели часто теряют эти типичные изменения <SUP> 7. Кроме того, генетическая профилирование не предложила ожидаемые выгоды, которые могут отражать тот факт, что генетические и эпигенетические изменения не всегда прогнозирования изменений на уровне активности белка, где большинство киназа таргетингом агенты действуют непосредственно, и где терапия с другими механизмами действия могут действовать косвенно.
Традиционная увековечены клеточная линия, которая может быть пассировать до бесконечности уже давно стандарт для тестирования на наркотики из-за их простоты обслуживания и воспроизводимости. Тем не менее, эта модель страдает от среды роста высокое содержание питательных веществ (и искусственный), который выбирает для быстро растущих клеток, которые сильно отличаются от первоначальной опухоли. Таким образом, наблюдается значительный интерес к разработке более реалистичных моделей систем, которые отражают более сложную биологическую систему опухоли как присутствует в организме пациента. Ксенотрансплантатов разработан непосредственно из первичной опухоли у мышей, выращенных ( "xenoline" пациента, полученных ксенотрансплантата или PDX) ProViде более отражающими модель системы, в частности , в установлении лечения рака, так как они ощущаются более надежно прогнозировать клинический успех. 8 Несмотря на более отражающей биологии, эти модели являются дорогостоящими и трудно установить и поддерживать. К тому же, они не поддаются исследованиям с высокой пропускной способностью. Необходимость лучше развивать биологические модели, которые более точно отражают молекулярные изменения в первичных опухолях, а также к профилю и тестировать эти модели, используя прямые измерения активности киназы, не суррогатной генетические маркеры, ясно.
Хорошо известно , что в отличие от двумерных (2D) однослойных культур, 3D или многоклеточные модели анализа могут обеспечить более физиологически соответствующие конечные точки 9-11. Общие 3D культуры подходы включают матрицы с покрытием микроносителей и формирования клеток сфероид. Опухолевые сфероиды могут быть получены с помощью клеточной агрегации с использованием вращающуюся колбу, ПХЕМА пластину и висит методы падения. Ограничения для тHESE подходы включают в себя: неспособность для некоторых клеток с образованием стабильных сфероиды, изменчивость роста и проблемы со смешанными типами клеток. В качестве альтернативы, многие синтетические (гидрогель, полимер) и животного происхождения Engelbreth-Holm-Swarm матрица (ГЭП) от саркомы мыши, бычьего коллагена) матрицы разработаны для 3D культуры изучает 12-14. Матрица Mouse EHS широко используется , но , как известно, способствуют росту и дифференциации клеток в пробирке и в естественных условиях 15.
Для того , чтобы воспроизвести 3D биологии опухоли, система Biomatrix человек была разработана доктором Радж Сингх и др. 16. Фактор-свободный человек биогель естественно, рост позволяет 3D культуры строительных лесов (бусы, диски), которые поддерживают долгосрочное культивирование нескольких типов клеток. Серия 3D-дизайнов человеческой культуры биогель созданы для изучения роста опухоли, адгезии, ангиогенеза и инвазии свойства. Преимущества и свойства человеческого биогель по сравнению с общиммышь EHS гели представлены в таблице 1 и таблице 2.
| Источник: | Человек Amnions (Объединенное ткань) Патогена, IRB освобожденной / одобрено |
| ECM характер: | Неденатурированный биогелем (GLP-производство) |
| ключ Компоненты: | Col-I (38%), ламинин (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), энтактин & HSPG (<3%) |
| GF-бесплатно: | Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non ангиогенеза, нетоксичный) |
Таблица 1: Свойства человека Биогеля , как по сравнению с обычными EHS Гели.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wiго-next.within-страница = "всегда">Таблица 2: Преимущества человеческого Биогеля , как по сравнению с обычными EHS Гели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках протокола в основном относятся к microtumor поколения, а также дозирование лекарственного средства и обслуживание. Поскольку microtumor шарики являются хрупкими и легко рвутся, крайняя осторожность необходима в обеих стадиях развития анализе и технического обслужива…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
При поддержке гранта NIH R21 (PI: С. Уилли, CA185712-01), Brain награду Опухоль SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) и договор SBIR (PI: Р. Сингх, N43CO-2013-00026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
