Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
Los tumores cerebrales primarios más comunes intracraneales malignos son astrocitomas de grado III y grado IV glioblastoma multiforme (glioblastoma). Estos tumores se ofrecen con peor pronóstico de supervivencia a un año de media entre 12 – 15 meses, con las terapias actuales para GBM en el 1-3 de Estados Unidos. terapias multimodales son la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia que incluye temozolomida (TMZ) y agentes quinasa específica. la señalización de la quinasa con frecuencia se desregula en GBM, incluyendo subgrupos de tumores con amplificación o la activación de mutaciones en el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el aumento de crecimiento derivado de plaquetas receptor del factor de plaquetas (PDGFR) de señalización, el aumento de la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) y tumor de soporte de señalización angiogénica a través de crecimiento endotelial vascular Factor receptor (VEGFR), así como otras vías de quinasa impulsado 4-6. Current in vitro y en modelos in vivo con frecuencia pierden estas alteraciones representativos <sup> 7. Además, el perfil genético no ha ofrecido los beneficios anticipados que pueden reflejar el hecho de que los cambios genéticos y epigenéticos no siempre predicen cambios en el nivel de actividad de la proteína, donde la mayoría de quinasa agentes de direccionamiento actúan directamente, y donde las terapias con otros mecanismos de acción pueden actuar indirectamente.
La línea celular inmortalizada tradicional que puede ser pasado hasta el infinito ha sido durante mucho tiempo el estándar para las pruebas de drogas debido a su facilidad de mantenimiento y reproducibilidad. Sin embargo, este modelo sufre de un entorno de crecimiento alta de nutrientes (y artificial) que selecciona las células que se diferencian en gran medida del tumor original de rápido crecimiento. Como tal, ha habido un considerable interés en el desarrollo de sistemas de modelo más realista que reflejan un sistema biológico tumor más complejo como está presente en el paciente. xenoinjertos de tumores desarrollan directamente de un tumor primario crecido en ratones ( "xenoline," xenoinjerto derivado del paciente o PDX) provide un sistema de modelo más reflectante, en particular en el contexto de la terapéutica del cáncer, ya que se sienten de predecir de manera más fiable el éxito clínico. 8 A pesar de la biología más reflexivo, estos modelos son caros y son difíciles de establecer y mantener. Además, no son susceptibles de alto rendimiento estudios. La necesidad de desarrollar mejores modelos biológicos que reflejan con mayor precisión las alteraciones moleculares en los tumores primarios, y al perfil y probar estos modelos a través de medidas directas de la actividad quinasa, no subrogarse marcadores genéticos, está claro.
Es bien sabido que a diferencia de dos dimensiones cultivos en monocapa (2D), los modelos de ensayo multicelulares 3D o pueden proporcionar más fisiológicamente puntos finales pertinentes 9-11. cultura 3D enfoques comunes implican microvehículos recubiertos de matriz y la formación de esferoides de células. esferoides tumorales se pueden generar a través de la agregación celular usando matraz de agitación, placa pHEMA y colgando técnicas de caída. Limitaciones para tenfoques stos incluyen: la incapacidad de algunas células para formar esferoides estables, la variabilidad en el crecimiento y desafíos con los tipos de células mixtas. Alternativamente, muchos sintético (hidrogel, polímero) y animal derivados de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de ratón, colágeno bovino) matrices se han desarrollado para el cultivo 3D estudia 12-14. Matriz de ratón EHS se utiliza ampliamente pero conocido por promover el crecimiento y la diferenciación celular in vitro e in vivo 15.
Con el fin de replicar la biología del tumor 3D, un sistema de biomatriz humana fue desarrollado por el Dr. Raj Singh et al. 16. El Biogel humana sin factor natural, el crecimiento de cultivo permite andamios 3D (perlas, discos), que apoyan el cultivo a largo plazo de varios tipos de células. Se establecen una serie de diseños de cultivo Biogel humana 3D para el estudio de las propiedades del crecimiento tumoral, la adhesión, la angiogénesis y la invasión. Ventajas y propiedades de Biogel humano en comparación con comúngeles ratón EHS se resumen en la Tabla 1 y la Tabla 2.
| Fuente: | Amnios humano (tejido agrupado) Libres de patógenos, IRB-exentos / aprobado |
| Naturaleza ECM: | Biogel no desnaturalizado (GLP-producción) |
| Llave componentes: | Col-I (38%), laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactina y HSPG (<3%) |
| GF-libre: | Indetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogénico, no tóxico) |
Tabla 1: Propiedades de Biogel humano en comparación con geles de EHS comunes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wiTH-next.within-page = "always">Tabla 2: Ventajas de Biogel humano en comparación con geles de EHS comunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo predominantemente refieren a microtumor generación, así como la dosificación del fármaco y el mantenimiento. Debido a que las cuentas microtumor son frágiles y fácilmente desgarrado, es necesario tener cuidado extremo en ambas etapas de desarrollo de un ensayo y mantenimiento. Si se produce un error durante cualquiera de estos procesos, la interpretación experimental puede verse comprometida, provocando la extensión o la repetición innecesaria de los experimentos o incluso la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyado por el NIH subvención R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor premio de esporas (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) y el contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013 a 00.026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
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