Generation Microtumors Använda 3D Human Biogel odlingssystemet och patientgenererade glioblastomceller för Kinomic Profilering och läkemedelssvar Testing
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
De vanligaste primära intrakraniella elakartade hjärntumörer är grad III astrocytom och grad IV glioblastoma multiforme (glioblastom eller GBM). Dessa tumörer har dålig prognos med median ettårsöverlevnad mellan 12 – 15 månader med nuvarande terapier för GBM i USA 1-3. Multimodalitet behandlingar inkluderar kirurgi, strålning och kemoterapi inklusive temozolomid (TMZ) och kinasinriktade medel. Kinassignalerings ofta dysreglerad i GBM, inklusive undergrupper av tumörer med amplifiering eller aktiverande mutationer i den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR), ökningar i Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) signalering, ökade fosfatidyl-inositol-3-kinas (PI3K) och tumör stödja angiogena signalering genom Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) såväl som andra kinas drivna banor 4-6. Ström in vitro- och in vivo-modeller förlorar ofta dessa representativa förändringar <sup> 7. Dessutom har genetisk profilering erbjuds inte de förväntade fördelarna som kan återspegla det faktum att genetiska och epigenetiska förändringar inte alltid förutsäga förändringar i nivå med proteinaktivitet, där de flesta kinasmålsökande medel verkar direkt, och där behandlingar med andra verkningsmekanismer kan fungera indirekt.
Den traditionella immortaliserad cellinje som kan passe det oändliga har länge varit standard för drogtestning på grund av att de är lätta att underhåll och reproducerbarhet. Men lider denna modell från en hög näringsämne (och artificiell) tillväxtmiljö som väljer för snabbväxande celler som skiljer sig avsevärt från den ursprungliga tumören. Som sådan, har det funnits ett stort intresse för att utveckla mer realistiska modellsystem som återspeglar en mer komplex tumör biologiskt system som är närvarande i patienten. Tumörxenografter utvecklats direkt från en primärtumör odlad i möss ( "xenoline," patient-derived xenotransplantat eller PDX) bestämde en mer reflekterande modellsystem, särskilt i fastställandet av cancerterapi, eftersom de upplevs mer tillförlitligt förutsäga klinisk framgång. 8 Trots mer reflekterande biologi, dessa modeller är dyra och svåra att införa och upprätthålla. Dessutom är de inte mottagliga för hög genomströmning studier. Behovet av att bättre utveckla biologiska modeller som mer exakt speglar molekylära förändringar i de primära tumörer och att profilera och testa dessa modeller med hjälp av direkta åtgärder av kinasaktivitet, inte surrogat genetiska markörer, är tydlig.
Det är väl känt att 3D eller flercelliga analysmodeller till skillnad från två-dimensionella (2D) monolagerkulturer kan ge mer fysiologiskt relevanta endpoints 9-11. Gemensam 3D kultur närmar innebär matrisbelagda mikrobärare och cell sfäroid formation. Tumör sfäroider kan genereras via cellulär aggregering med hjälp av spinnkolv, PHEMA plattan och droppe tekniker. Begränsningar för tessa strategier inkluderar: oförmåga för vissa celler att bilda stabila sfäroider variationer i tillväxt och utmaningar med blandade celltyper. Alternativt, många syntetiska (hydrogel, polymer) och djur-härledda Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris från mus sarkom, bovint kollagen) matriser har utvecklats för 3D kulturstudier 12-14. Mus EHS matris används flitigt men känt för att gynna celltillväxt och differentiering in vitro och in vivo 15.
För att replikera 3D tumörbiologi, var en människa biomatris system som utvecklats av Dr. Raj Singh et al. 16. Den naturliga, tillväxtfaktor-fri människa Biogel tillåter 3D kultur ställningar (pärlor, skivor), som stöder långsiktig odling av flera celltyper. En serie av 3D mänsklig Biogel kultur mönster etableras för att studera tumörtillväxt, adhesion, angiogenes och invasion egenskaper. Fördelar och egenskaper hos mänskliga Biogel jämfört med vanligtmus EHS-geler är sammanfattade i Tabell 1 och Tabell 2.
| Källa: | Human Amnions (poolade vävnad) Patogenfria, IRB-befriad / godkänd |
| ECM natur: | Icke-denaturerad Biogel (GLP-produktion) |
| Nyckel Komponenter: | Col-I (38%), laminin (22%), col-IV (20%), col-III (7%), entaktin & HSPG (<3%) |
| GF-free: | Oidentifierbart EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (icke-angiogena, Giftfri) |
Tabell 1: Egenskaper för Human Biogel Jämfört med vanliga EHS Gel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = "always">Tabell 2: Fördelar med Human Biogel Jämfört med vanliga EHS Gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet avser främst att microtumor generation, liksom läkemedelsdosering och underhåll. Eftersom microtumor pärlorna är ömtåliga och lätt sönder, krävs extrem försiktighet i både utvecklingsstadier av en analys och underhåll. Om ett fel inträffar under någon av dessa processer, kan experimentell tolkning äventyras, vilket förlängningen eller onödig upprepning av experimenten eller uteslutning av data.
Modifieringar och felsökning, särskilt när det g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av NIH R21 bidrag (PI: C. Willey, CA185712-01), hjärntumör SPORE tilldelning (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129 till 03) och SBIR kontrakt (PI: R. Singh, N43CO-2013 till 00.026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
