نمذجة العضلي الضمور 1 في خلايا C2C12 بالخلايا العضلية الجذعية
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن تقديم الإجراءات في تأسيس العضلي ضمور 1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية، بما في ذلك تحسين صيانة C2C12 الخلية، ترنسفكأيشن الجينات / التنبيغ، والتمايز العضلية.
Abstract
العضلي ضمور 1 (DM1) هو شكل شائع من الضمور العضلي. على الرغم من أن وضعت عدة نماذج حيوانية لDM1، ونماذج خلية بالخلايا العضلية الجذعية لا تزال مهمة لأنها توفر بديلا الخلوي فعال لدراسة الأحداث الخلوية والجزيئية. على الرغم من الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية C2C12 استخدمت على نطاق واسع لدراسة تكون العضل، ومقاومة للترنسفكأيشن الجينات، أو تنبيغ الفيروسية، يعيق البحوث في الخلايا C2C12. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل الذي يتضمن إجراءات الصيانة اليومية، ترنسفكأيشن والتنبيغ لإدخال الجينات إلى myoblasts C2C12 وتحريض التمايز العضلية. بشكل جماعي، وتمكن هذه الإجراءات أفضل الكفاءات ترنسفكأيشن / تنبيغ، فضلا عن نتائج المفاضلة متسقة. بروتوكول صفها في إنشاء DM1 نماذج الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية يمكن أن تستفيد الدراسة من الضمور العضلي، فضلا عن غيرها من أمراض العضلات.
Introduction
العضلي الضمور (DM) هو مرض وراثي جسمي قاهر التي تؤثر على أنظمة متعددة، وأهمها القلب والهيكل العظمي العضلات 1. هناك نوعين من هذا المرض، DM1 وDM2. DM1 هو أكثر شيوعا، ولها مظهر أكثر شدة من DM2 2. الطفرة الوراثية الكامنة DM1 هو التوسع في تكرار ثلاثية CUG تقع في منطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من DM بروتين كيناز الجين (DMPK) 3. عدد CUG تكرار في الأفراد تتأثر يختلف من 5 إلى 37. في المقابل، ترتفع إلى أكثر من 50 عاما، وأحيانا تصل إلى الآلاف في المرضى الذين يعانون DM1 4. ونتيجة لذلك، والبروتينات ملزم RNA، مثل muscleblind مثل 1 (MBNL1)، CUGBP، وElav مثل العائلة 1 (Celf1)، هي misregulated. بسبب الحراسة على تكرار CUG الموسعة، MBNL1 يفقد قدرته على تنظيم الربط البديل 5. Celf1، من ناحية أخرى، يصل ينظم 6،7. ويرتبط overexpression من Celf1 مع فقدان العضلاتوالضعف، والتي لا تنسب إلى فقدان وظيفة MBNL1. النماذج الحيوانية محاكاة التعديلات المتعلقة DM1، بما في ذلك DMPK 3'-UTR CUG التوسع، وفقدان MBNL1، وoverexpression من Celf1، أنشئت. ومع ذلك، والنمذجة DM1 في myoblasts يوفر بديلا فعالا، خاصة بالنسبة للتشريح الأحداث الخلوية والجزيئية ذات الصلة DM1.
تم عزل C2C12 خط الخلية بالخلايا العضلية الجذعية أول من أصيب العضلات C3H الماوس وتستخدم على نطاق واسع لدراسة عضلي 8،9 التمايز. خلايا C2C12 تتكاثر بسرعة في مصل بقري جنيني (FBS) المحتوية على وسائل الإعلام وبسهولة الخضوع التمايز عندما يتم استنفاد FBS. بعد، وذلك باستخدام هذا النموذج بالخلايا العضلية الجذعية التمايز يقدم تحديين: خلايا C2C12 مقاومة لترنسفكأيشن الجينات / تنبيغ الفيروسية كثير من الأحيان؛ وهناك اختلافات طفيفة في معالجة الخلايا وإجراء المفاضلة يمكن أن يؤدي إلى تغيرات ملحوظة في تشكيل myotube مركزيا.
مختبرنا يستخدم بشكل روتيني myoblasts C2C12 كما ميلانوقد وضعت الذراع نموذج والبروتوكولات التي تقدم على نحو فعال الجينات ترنسفكأيشن البلازميد، تنبيغ فيروسات، وتنبيغ lentiviral إلى خط الخلية C2C12 10. في الفيديو، ونحن لشرح إجراءات الأمثل لtransfecting / transducing C2C12 الخلايا والحفاظ على التمايز الاتساق في إنشاء DM1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم استخدام خط الخلية C2C12 كنموذج لدراسة تكون العضل 11-14. هذه الخلايا تحتفظ نظرة تشبه الخلايا الليفية، تتكاثر بسرعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ الجنين المصل البقري والتفريق بسهولة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 2٪ مصل الخيول 15. نمو سريع والتمايز ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
