C2C12 Miyoblast Hücrelerde Myotonik Distrofi 1 Modelleme
Summary
Bu protokol, biz optimize C2C12 hücre bakım, gen transfeksiyon / transdüksiyon ve miyosit farklılaşma dahil miyotonik distrofi 1 myoblast modelleri, kurulması prosedürleri sunuyoruz.
Abstract
Miyotonik distrofi 1 (DM1) müsküler distrofi yaygın bir şeklidir. çeşitli hayvan modelleri DM1 için kurulmuş olmasına rağmen onlar hücresel ve moleküler olayları incelemek için etkili bir hücresel alternatif sunmak, çünkü myoblast hücre modelleri hala önemlidir. C2C12 miyoblast hücreleri yaygın gene ya da viral transdüksiyon ile Miyogenesis direnç incelemek için kullanılmıştır olmasına rağmen, C2C12 hücre araştırma engellemektedir. Burada, C2C12 iskelet hücreleri ve miyosit farklılaşmanın başlaması içine genleri tanıtmak için günlük bakım, transfeksiyon ve transdüksiyon prosedürleri içerir optimize edilmiş bir protokol açıklar. Toplu olarak, bu işlemler iyi transfeksiyon / transdüksiyon verimliliği, hem de uyumlu farklılaşma sonuçlarını verir. miyotonik distrofi çalışma, hem de diğer kas hastalıkları yararlanacak DM1 miyoblast hücre modellerinin oluşturulması açıklanan protokol.
Introduction
Miyotonik distrofi (DM) birden fazla sistemi, en önemlisi kalp ve iskelet kasları 1 etkileyen otozomal dominant bir hastalıktır. Bu hastalıkta, DM1 ve DM2 iki alt tipi vardır. DM1 daha sık görülür ve DM2 2 daha ciddi bir tezahürü vardır. DM1 yatan genetik mutasyon 3 'çevrilmemiş bölge DM protein kinaz geni (DMPK) 3 (UTR) bulunan KKG üçüz tekrarlarının bir açılımıdır. Etkilenmemiş kişilerde KKG tekrar sayısı aksine 37'ye 5 ila, daha fazla 50 artar ve bazen DM1 hastalarının 4'te binlerce değişir. Bunun bir sonucu olarak, bu gibi RNA bağlayıcı proteinler,-kas benzeri 1 (MBNL1) CUGBP ve Elav benzeri Aile 1 (Celf1), düzeni bozulmuş bulunmaktadır. Nedeniyle genişletilmiş KKG tekrarlarda haciz, MBNL1 alternatif yapıştırma 5 düzenleyen yeteneğini kaybeder. Celf1, diğer taraftan, 6,7 yukarı düzenlenir. Celf1 aşırı ekspresyonu kas kaybı ile ilişkilidirMBNL1 fonksiyon kaybına atfedilen değildir ve halsizlik. DMPK 3'-UTR KKG genişleme, MBNL1 kaybı ve Celf1 aşırı ifadesi de dahil olmak üzere DM1 ile ilgili değişiklikleri, simüle Hayvan modelleri, kurulmuştur. Ancak, miyoblastların içinde DM1 modelleme özellikle DM1 ile ilgili hücresel ve moleküler olayları diseksiyon için, etkili bir alternatif sunuyor.
C2C12 myoblast hücre hattı ilk yaralı C3H fare kas izole ve yaygın Miyojenik farklılaşma 8,9 incelemek için kullanılmıştır. C2C12 hücreleri hızla cenin sığır serumu (FBS) ortam ihtiva-eden prolifere ve kolayca FBS boşaldığında farklılaşma tabi tutulur. Oysa, bu myoblast farklılaşma modeli kullanılarak iki zorluğu beraberinde getirir: C2C12 hücreleri sıklıkla gen transfeksiyonu / viral transdüksiyon dirençlidir; ve hücre işleme ve farklılaşma prosedüründe küçük farklılıklar mihotüp oluşumunda belirgin değişikliklere yol açabilir.
Bizim laboratuvar rutin ac olarak C2C12 miyoblastları kullanırell modeli ve etkili bir C2C12 hücre hattına 10 plazmid transfeksiyon, retroviral kalıt ve lentiviral transdüksiyonu ile genleri teslim protokolleri geliştirilmiştir. videoda, / transfekte C2C12 hücrelerini transduse ve DM1 myoblast modelleri kurulmasında farklılaşma tutarlılığını sağlamak için optimize prosedürleri göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
C2C12 hücre hattı Miyogenesis 11-14 incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Bu hücreler, bir fibroblast-benzeri bir görünüm korumak,% 20 fetal inek serumu ihtiva eden ortamda hızla çoğalan ve hali hazırda% 2 at serumu 15 ihtiva eden ortam içinde farklılık gösterir. Hızlı büyüme ve farklılaşma bir Miyogenesis hücre modelinde avantajlı özellikleridir. Burada, C2C12 hücrelerine cDNA, 3'-UTR ve shRNA tanıtmak plazmid retroviral ve lentiviral vektörleri kullan?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
