C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化
Summary
このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。
Abstract
筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。
Introduction
筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 '非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3'-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解剖するために、効率的な代替手段を提供しています。
C2C12筋芽細胞株は、最初に負傷したC3Hマウスの筋肉から単離され、広く筋原性分化8,9を研究するために使用しました。 C2C12細胞は急速にウシ胎児血清（FBS）培地を含有して増殖し、容易にFBSが枯渇したとき分化を受けます。しかし、この筋芽細胞分化モデルを使用して2つの課題を提示する：C2C12細胞は、多くの場合、遺伝子導入/形質導入、ウイルスに対して耐性です。および細胞取り扱いおよび分化手順のわずかな変動は、筋管形成の著しい変化につながることができます。
私たちの研究室では、日常的に交流としてC2C12筋芽細胞を使用していますエル・モデルと効果的C2C12細胞株10へのプラスミドのトランスフェクション、レトロウイルス形質導入、およびレンチウイルス形質導入によって遺伝子を送達プロトコルを開発しました。ビデオでは、我々は/トランスフェクトC2C12細胞に形質導入し、DM1の筋芽細胞モデルの確立に分化一貫性を維持するための最適化された手順を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3'-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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