Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos
Summary
Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.
Abstract
A distrofia miotônica 1 (DM1) é uma forma comum de distrofia muscular. Embora vários modelos animais foram estabelecidos para DM1, modelos celular de mioblastos ainda são importantes porque eles oferecem uma alternativa eficiente celular para estudar eventos celulares e moleculares. Embora as células C2C12 de mioblastos tem sido amplamente utilizado para estudar a miogenese, a resistência à transfecção do gene, ou a transdução virai, dificulta a pesquisa em células C2C12. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado que inclui procedimentos de manutenção diária, transfecção e transdução para introduzir genes em mioblastos C2C12 e a indução de diferenciação dos miócitos. Colectivamente, estes processos permitem melhores eficiências de transfecção / transdução, bem como os resultados consistentes de diferenciação. O protocolo descrito no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1 celulares beneficiaria o estudo de distrofia miotónica, bem como outras doenças musculares.
Introduction
Distrofia miotônica (DM) é uma doença autossômica dominante que afeta vários sistemas, principalmente músculos cardíacos e esqueléticos 1. Existem dois subtipos da doença, DM1 e DM2. DM1 é mais comum e tem uma manifestação mais grave do DM2 2. A mutação genética subjacente DM1 é uma expansão de repetições de tripletos CUG localizado na região não traduzida 3 '(UTR) do gene da proteína quinase MS (DMPK) 3. O número de repetição CUG em indivíduos não afectados varia de 5 a 37. Por outro lado, aumenta a mais de 50, e, por vezes, até milhares em doentes DM1 4. Como resultado, as proteínas de ligação a ARN, tais como muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP, e elav-1 como família (Celf1), são desregulada. Devido ao sequestro nas repetições CUG expandidas, MBNL1 perde a sua capacidade de regular a splicing alternativo 5. Celf1, por outro lado, é sobre-regulada 6,7. A sobre-expressão de Celf1 está associada com a perda de músculoe fraqueza, que não são atribuídos a perda da função MBNL1. Os modelos animais simulando alterações relacionadas-DM1, incluindo DMPK 3'-UTR expansão CUG, perda de MBNL1, e superexpressão de Celf1, foram estabelecidas. No entanto, a modelagem DM1 em mioblastos oferece uma alternativa eficiente, especialmente para dissecar eventos celulares e moleculares relacionados-DM1.
A linha celular de mioblastos C2C12 foi isolado pela primeira vez a partir de músculo de rato C3H feridos e amplamente utilizado para estudar diferenciação 8,9 miogénica. células C2C12 proliferam rapidamente em soro fetal bovino (FBS) molecular contendo meios e prontamente sofrer diferenciação de FBS quando se esgota. No entanto, usando este modelo de diferenciação de mioblastos apresenta dois desafios: células C2C12 são muitas vezes resistentes a transfecção de genes / transdução viral; e pequenas variações na manipulação celular e processo de diferenciação pode levar a alterações marcadas na formação de miotubos.
Nosso laboratório utiliza rotineiramente mioblastos C2C12 como acmodelo ell e desenvolveu protocolos que efetivamente entregar genes por transfecção de plasmídeo, transdução retroviral, e transdução lentiviral em linha celular C2C12 10. No vídeo, demonstramos os procedimentos otimizados para transfecção / transdução C2C12 células e manter a consistência diferenciação no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A linha de células C2C12 foi usado como um modelo para estudar miogénese 11-14. Estas células manter uma aparência do tipo fibroblastos, proliferam rapidamente em meios contendo 20% de soro fetal bovino e facilmente diferenciar em meio contendo 2% de soro equino 15. O rápido crescimento e diferenciação são características vantajosas em um modelo de célula miogénese. Aqui, demonstramos a utilização de plasmídeo, retroviral, e vectores lentivirais para introduzir ADNc, 3'-UTR, e shR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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