דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.
Abstract
Myotonic ניוון 1 (DM1) היא צורה נפוצה של ניוון שרירים. למרות במודלים של בעלי חיים כמה הוקמו DM1, מודלי תא myoblast הם עדיין חשובים משום שהם מציעים אלטרנטיבה הסלולר ביותר ללימוד אירועים תאיים ומולקולריים. למרות תאים myoblast C2C12 כבר בשימוש נרחב ללמוד myogenesis, עמידות transfection הגן, או התמרה ויראלית, מעכבת מחקר בתאי C2C12. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה הכולל תחזוקה יומית, נהלי transfection התמר להציג גנים לתוך myoblasts C2C12 ואת האינדוקציה של בידול myocyte. ביחד, נהלים אלה לאפשר יעילות transfection / תמרה הטובות ביותר, כמו גם תוצאות בידול עקביות. הפרוטוקול המתואר בהקמת מודלי תא myoblast DM1 ירוויח לחקר ניוון myotonic, כמו גם מחלות שרירים אחרות.
Introduction
ניוון Myotonic (DM) הוא מחלה דומיננטית אוטוזומלית המשפיעה מערכות מרובות, בעיקר שרירי לב שלד 1. ישנם שני תת סוגים של המחלה הזאת, DM1 ו DM2. DM1 נפוץ יותר ויש לו ביטוי חמור יותר DM2 2. המוטציה הגנטית הבסיסית DM1 היא רחבה של חזרות שלישיית CUG הממוקמות באזור המתורגם '3 (UTR) של גן החלבון קינאז DM (DMPK) 3. מספר חוזרי CUG אצל אנשים לא מעושה משתנה בין 5 ל 37. לעומת זאת, היא מגדילה ליותר מ -50, ולפעמים עד אלף בחולי DM1 4. כתוצאה מכך, חלבונים קושרי RNA, כגון muscleblind דמוי 1 (MBNL1), CUGBP, ו Elav-כמו משפחה 1 (Celf1), הם misregulated. בשל התפיסה על חזרות CUG המורחבות, MBNL1 מאבד את יכולתו לווסת שחבור חלופי 5. Celf1, ומצד שני, הוא למעלה מוסדר 6,7. התבטאות יתר של Celf1 קשורה לאובדן שרירחולשה, אשר אינן מיוחסות אובדן תפקוד MBNL1. במודלים של בעלי חיים לדמות שינויים הקשורים DM1, ובכלל זה, הרחבת DMPK 3'-UTR CUG, אובדן MBNL1, ואת יתר של Celf1, הוקמו. עם זאת, דוגמנות DM1 ב myoblasts מציעה אלטרנטיבה יעילה, במיוחד עבור לנתח הקשורות DM1 אירועים תאיים ומולקולריים.
C2C12 שורת תאי myoblast בודד לראשונה מ שריר עכבר C3H נפצע בשימוש נרחב ללמוד 8,9 בידול myogenic. תאי C2C12 להתרבות במהירות בסרום שור עובר (FBS) המכיל תקשורת לעבור התמיינות בקלות כאשר FBS ייגמר. עם זאת, באמצעות מודל בידול myoblast זה מציג שני אתגרים: תאי C2C12 הם בדרך כלל עמידים בפני transfection גן / תמרה ויראלית; ו שינויים קלים טיפול תא הליך בידול יכולים להוביל לשינויים חדים בהשקעות myotube.
המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמש myoblasts C2C12 כמו acell מודל פתח פרוטוקולים להעברת גנים ביעילות על ידי transfection פלסמיד, תמרת retroviral, תמרת lentiviral לתוך תא C2C12 קו 10. בסרטון, אנחנו מדגימים את הנהלים אופטימיזציה עבור transfecting / transducing C2C12 תאים ושמירה על עקביות בידול בהקמת מודלים myoblast DM1.
Protocol
Representative Results
Discussion
שורת תאים C2C12 נוצל בעבר כמודל ללמוד myogenesis 11-14. תאים אלה לשמור על המראה כמו-פיברובלסטים, להתרבות במהירות מדיה המכילה 20% בסרום שור העובר ולבדל בקלות מדיה המכילה 2% נסיוב סוס 15. הצמיחה וההתבדלות מהר הם מאפייני יתרון מודל תא myogenesis. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש פל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
