Dans ce protocole, nous présentons les procédures pour établir la dystrophie 1 modèles de myoblastes myotonique, y compris la maintenance optimisée C2C12 cellulaire, la transfection de gènes / transduction, et la différenciation des myocytes.
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Article de méthode
Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dystrophie myotonique 1 (DM1) est une forme courante de dystrophie musculaire. Bien que plusieurs modèles animaux ont été établis pour DM1, les modèles de cellules myoblastes sont encore importants, car ils offrent une alternative cellulaire efficace pour étudier les événements cellulaires et moléculaires. Bien que les cellules de myoblastes C2C12 ont été largement utilisés pour étudier la myogenèse, la résistance à la transfection de gènes, ou une transduction virale, empêche la recherche dans des cellules C2C12. Ici, nous décrivons un protocole optimisé comprenant des procédures d'entretien quotidien, la transfection et de transduction pour introduire des gènes dans des myoblastes C2C12 et l'induction de la différenciation des myocytes. Collectivement, ces procédés permettent de meilleurs rendements de transfection / transduction, ainsi que des résultats de la différenciation cohérente. Le protocole décrit dans l'établissement de modèles de cellules myoblastes DM1 bénéficierait l'étude de la dystrophie myotonique, ainsi que d'autres maladies musculaires.
Introduction
La dystrophie myotonique (DM) est une maladie autosomique dominante qui affecte plusieurs systèmes, plus particulièrement les muscles cardiaques et squelettiques 1. Il existe deux sous-types de cette maladie, DM1 et DM2. DM1 est plus fréquente et a une manifestation plus sévère que DM2 2. La mutation génétique sous - jacente DM1 est une expansion de répétitions de triplets CUG situées dans la région 3 'non traduite (UTR) du gène de la protéine kinase de DM (DMPK) 3. Le nombre de répétitions CUG dans les individus non affectés varie de 5 à 37. En revanche, elle augmente à plus de 50, et parfois jusqu'à des milliers de patients ....
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Protocole
1. C2C12 Culture cellulaire
- Maintenir les myoblastes de souris C2C12 dans une plaque de 100 mm dans du milieu de croissance (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)) supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 20%, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Laisser les cellules C2C12 à des passages à devenir environ 50 - 60% de confluence.
- Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec une solution saline 3 ml température ambiante tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et on ajoute 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA pour détacher les cellules. Placer la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO
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Résultats
les cellules C2C12 ont été transfectées avec GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Après la sélection de résistance aux médicaments, les pools stables ont été établies, qui peut être visualisée par l' expression de GFP (figure 1A). La formation de myotubes dans les myoblastes différenciés a été détectée par la myosine chaîne lourde immunocoloration 10 (figure 1B). La quantification de la formation de myotubes ont démontré que les indices de fusion ont é.......
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Discussion
Lignée cellulaire C2C12 a été utilisé comme modèle pour étudier la myogenèse 11-14. Ces cellules conservent un aspect fibroblaste, prolifèrent rapidement dans les milieux contenant 20% de sérum fœtal bovin et facilement différencier dans un milieu contenant 2% de sérum équin 15. La croissance rapide et la différenciation sont des caractéristiques avantageuses dans un modèle cellulaire de la myogenèse. Ici, nous démontrons l'utilisation du plasmide, rétroviral et vecteurs lentiviraux pour introd.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions les Drs Tom Cooper du Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan de l’Université du Wisconsin-Madison et Didier Trono de l’Université de Genève pour les réactifs. Ce travail est soutenu par un fonds de démarrage de l’Université de Houston (YL), une subvention de l’American Heart Association (YL, 11SDG5260033) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (XP, 81460047).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM, hyperglucose | Life Technologies | 11965-084 | pour milieu de culture |
| Sérum de veau fœtal - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | pour milieu de culture |
| Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | pour milieu de culture |
| Insuline du pancréas bovin | Sigma Aldrich | I6634-100MG | pour milieu de différenciation |
| sérum équin | Atlanta Biologicals | S12150 | pour milieu de différenciation |
| FuGENE ; Réactif de transfection HD | Promega | E2311²� | pour la transfection |
| Sulfate de G418 | Biotechnologie de l’or ; | G-418-10 | pour la sélection de la résistance aux médicaments |
| Dichlorhydrate de puromycine | Sigma Aldrich | sc-108071 | pour la sélection de la résistance aux médicaments |
| NuPAGE Novex 4 - 12 % Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 puits | Life Technologies | NP0323BOX | pour western blot |
| NuPAGE Tampon de transfert (20x) | Life Technologies | NP00061 | pour western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | pour western blot |
| Amersham Protran Pris en charge 0,2 NC, 300 mm x 4 m | healthcare life science | 10600015 | pour western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | Anticorps primaire pour immunomarquage |
| Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) de chèvre, Texas Red-X conjugué | Thermo Fisher Scientific | T-862 | Anticorps secondaires immunocoloration |
| Une étape qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | pour qRT-PCR |
| TriPure Réactif d’isolement | Roche | 11667165001 | pour l’isolement de l’ARN |
| CUG-BP1 Anticorps (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primaire Ab western |
| blot Actine Anticorps | santa cruz | sc-1615 | chèvre polyclonale IgG pour le contrôle de chargement |
| 293T Ecopack | Cellules 631507 Clontech | pour la préparation des rétrovirus | |
| pMSCV-puro | Vecteur rétroviral vide | Clontech | 634401 |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-built | non disponible | vecteur rétroviral codant pour Celf1Flag, utilisé dans la préparation des rétrovirus |
| psPAX2 | cadeau de Didier Trono | non disponible | pour la préparation des lentivirus |
| Le cadeau pMD2.G | de Didier Trono | n’est pas disponible | pour la préparation du lentivirus |
| Le cadeau GFP-CUG5 | de M.S. Mahadevan n’est | pas disponible | détails dans la référence 10 ; |
| GFP- CUG200 | cadeau de M.S. Mahadevan | non disponible | détails dans la référence 10 ; |
| Triton ; X-100 | Sigma Aldrich | X100 | pour l’immunomarquage du |
| paraformaldéhyde | Sigma Aldrich | P6148 | pour l’immunomarquage |
| TWEEN ; 20 | Sigma Aldrich | P9416 | pour l’immunomarquage |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | pour l’immunomarquage |
Références
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
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Réimpressions et autorisations
