C2C12 Myoblast कक्ष में मायोटोनिक अपविकास 1 मॉडलिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम अनुकूलित C2C12 सेल रखरखाव, जीन अभिकर्मक / पारगमन, और myocyte भेदभाव सहित मायोटोनिक कुपोषण 1 myoblast मॉडल, स्थापित करने में प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मायोटोनिक कुपोषण 1 (DM1) पेशी dystrophy का एक आम रूप है। हालांकि कई पशु मॉडल DM1 के लिए स्थापित किया गया है, myoblast सेल मॉडल क्योंकि वे सेलुलर और आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक कुशल सेलुलर विकल्प प्रदान करते हैं अभी भी महत्वपूर्ण हैं। C2C12 myoblast कोशिकाओं को व्यापक रूप से जीन अभिकर्मक, या वायरल पारगमन के लिए myogenesis, प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है हालांकि, C2C12 कोशिकाओं में अनुसंधान hinders। यहाँ, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि दैनिक रखरखाव, अभिकर्मक और पारगमन प्रक्रियाओं C2C12 myoblasts और myocyte भेदभाव की प्रेरण में जीन को पेश करने में शामिल हैं का वर्णन है। सामूहिक रूप से, इन प्रक्रियाओं का सबसे अच्छा अभिकर्मक / पारगमन क्षमता है, साथ ही लगातार भेदभाव परिणामों को सक्षम। प्रोटोकॉल DM1 myoblast सेल मॉडल की स्थापना मायोटोनिक कुपोषण के अध्ययन के साथ-साथ अन्य मांसपेशियों की बीमारियों को लाभ होगा में वर्णित है।
Introduction
मायोटोनिक अपविकास (डीएम) एक autosomal प्रमुख रोग कई सिस्टम, सबसे विशेष रूप से हृदय और कंकाल की मांसपेशियों 1 को प्रभावित करता है। इस रोग, DM1 और DM2 के दो उपप्रकार होते हैं। DM1 ज्यादा आम है और DM2 2 की तुलना में अधिक गंभीर अभिव्यक्ति है। आनुवंशिक उत्परिवर्तन अंतर्निहित DM1 सीयूजी त्रिक 3 'untranslated क्षेत्र डीएम प्रोटीन काइनेज जीन (डीएमपीके) 3 के (UTR) में स्थित दोहराता की एक विस्तार है। अप्रभावित व्यक्तियों में सीयूजी नंबर दोहराने बदलता है 5 से 37. इसके विपरीत करने के लिए, यह और कभी कभी अप DM1 रोगियों 4 में हजारों लोगों के लिए 50 से अधिक बढ़ जाती है। नतीजतन, इस तरह के रूप में शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, muscleblind की तरह 1 (MBNL1), CUGBP, और elav की तरह परिवार 1 (Celf1), misregulated हैं। विस्तार किया सीयूजी दोहराता पर ज़ब्ती के कारण, MBNL1 वैकल्पिक splicing 5 को विनियमित करने की क्षमता खो देता है। Celf1, दूसरे हाथ पर, ऊपर से नियंत्रित किया जाता है 6.7। Celf1 की overexpression मांसपेशियों की हानि के साथ जुड़ा हुआ हैऔर कमजोरी है, जो MBNL1 समारोह के नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया नहीं कर रहे हैं। डीएमपीके 3'-UTR सीयूजी विस्तार, MBNL1 की हानि, और Celf1 की overexpression सहित DM1 संबंधी परिवर्तन, अनुकरण पशु मॉडल स्थापित किया गया है। हालांकि, myoblasts में DM1 मॉडलिंग विशेष रूप से DM1 से संबंधित सेलुलर और आणविक घटनाओं विदारक के लिए, एक कुशल विकल्प प्रदान करता है।
C2C12 myoblast सेल लाइन पहला घायल C3H माउस पेशी से पृथक किया गया है और व्यापक रूप myogenic भेदभाव 8,9 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया। C2C12 कोशिकाओं के तेजी से भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त मीडिया में पैदा करना और आसानी से भेदभाव से गुजरना जब FBS समाप्त हो गया है। फिर भी, इस myoblast भेदभाव मॉडल का उपयोग कर दो चुनौतियों प्रस्तुत करता है: C2C12 कोशिकाओं अक्सर जीन अभिकर्मक / वायरल पारगमन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं; और सेल हैंडलिंग और भेदभाव प्रक्रिया में मामूली बदलाव myotube गठन में चिह्नित परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
हमारी प्रयोगशाला नियमित तौर पर एसी के रूप में C2C12 myoblasts का उपयोग करता हैपक्ष मॉडल और प्रोटोकॉल है कि प्रभावी ढंग से C2C12 सेल लाइन 10 में प्लाज्मिड अभिकर्मक, रेट्रोवायरल पारगमन, और lentiviral पारगमन द्वारा जीन प्रदान विकसित की है। वीडियो में, हम परासंक्रमित / C2C12 कोशिकाओं transducing और DM1 myoblast मॉडल स्थापित करने में भेदभाव स्थिरता को बनाए रखने के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
Protocol
Representative Results
Discussion
C2C12 सेल लाइन myogenesis 11-14 अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इन कोशिकाओं को एक fibroblast की तरह देखो बनाए रखने, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मीडिया में तेजी से पैदा और आसानी से 2% घोड़े सीरम …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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