Modellering myotonika Dystrophy 1 i C2C12 myoblastceller
Summary
I detta protokoll presenterar vi procedurerna i upprättandet Dystrofia myotonika 1 myoblast modeller, inklusive optimerade C2C12 cell underhåll, gen transfektion / transduktion, och myocyt differentiering.
Abstract
Dystrofia myotonika 1 (DM1) är en vanlig form av muskeldystrofi. Trots att flera djurmodeller har fastställts för DM1, myoblast cellmodeller är fortfarande viktiga eftersom de erbjuder ett effektivt cellulär alternativ för att studera cellulära och molekylära händelser. Fastän C2C12 myoblastceller har använts i stor utsträckning för att studera myogenes, resistens mot gen transfektion eller viral transduktion, hindrar forskningen i C2C12-celler. Här beskriver vi en optimerad protokoll som inkluderar daglig underhålls transfektion och transduktion förfaranden för att införa gener i C2C12 myoblaster och induktion av myocyt differentiering. Tillsammans står dessa förfaranden möjliggör bästa transfektion / transduktion effektivitet, samt konsekventa differentierings resultat. Protokollet beskrivet i upprättandet DM1 myoblast cellmodeller skulle gynna studiet av myotonisk dystrofi, såväl som andra muskelsjukdomar.
Introduction
Dystrofia myotonika (DM) är en autosomalt dominant sjukdom som drabbar flera system, främst hjärt- och skelettmuskler 1. Det finns två subtyper av sjukdomen, DM1 och DM2. DM1 är vanligare och har en mer allvarlig manifestation än DM2 2. Den genetiska mutationen bakom DM1 är en utvidgning av CUG triplett upprepningar belägna i 3 'otranslaterade regionen (UTR) av DM proteinkinas-genen (DMPK) 3. SAG upprepa nummer i opåverkade individer varierar från 5 till 37. Däremot ökar det till mer än 50, och ibland upp till tusentals i DM1 patienter 4. Som ett resultat, RNA-bindande proteiner, såsom muscleblind liknande en (MBNL1), CUGBP och Elav-liknande familjen 1 (Celf1), är misregulated. På grund av den sekvestrering på de expanderade CUG upprepningar, förlorar MBNL1 dess förmåga att reglera alternativ splitsning 5. Celf1, å andra sidan, är uppreglerad 6,7. Överuttryck av Celf1 förknippas med muskelförlustoch svaghet, som inte tillskrivs förlust av MBNL1 funktion. Djurmodeller simulerar DM1-relaterade förändringar, inklusive DMPK 3'-UTR CUG expansion, förlust av MBNL1, och överuttryck av Celf1, har fastställts. Men modellering DM1 i myoblaster erbjuder ett effektivt alternativ, särskilt för att dissekera DM1-relaterade cellulära och molekylära händelser.
C2C12 myoblast-cellinjen isolerades först från skadade C3H mus muskel och används i stor utsträckning för att studera myogenic differentiering 8,9. C2C12-celler förökar sig snabbt i fetalt bovint serum (FBS) innehållande media och lätt undergår differentiering när FBS utarmas. Men att använda denna myoblast differentiering modell presenterar två utmaningar: C2C12-celler är ofta resistenta mot gen transfektion / virusöverföring; och små variationer i cell hantering och differentiering förfarandet kan leda till påtagliga förändringar i myotube bildning.
Vårt laboratorium rutinmässigt använder C2C12 myoblaster som acell modell och har utvecklat protokoll som effektivt leverera gener från plasmid transfektion, retroviral transduktion, och lentivirala transduktion i C2C12 cellinje 10. I videon visar vi optimerade förfaranden för transfektion / transduktion C2C12-celler och upprätthålla differentiering konsekvens i upprättandet DM1 myoblast modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
C2C12 cellinje har använts som en modell för att studera myogenes 11-14. Dessa celler bibehåller en fibroblast-liknande utseende, prolifererar snabbt i media innehållande 20% fetalt bovint serum och lätt differentiera i medium innehållande 2% hästserum 15. Den snabba tillväxten och differentieringen är fördelaktiga egenskaper i en myogenes cellmodell. Här visar vi användning av plasmid, retroviral och lentivirala vektorer för att introducera cDNA 3'-UTR, och shRNA i C2C12-celler. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
