القائم HPLC الفحص لمراقبة خارج الخلية النكليوتيد / نوكليوزيد الأيض في خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن الإنسان
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
يصف هذا الأسلوب حساسة ومحددة وموثوقة وقابلة للتكرار عكس المرحلة عالية الأداء اللوني السائل (RP-HPLC) فحص المتقدمة والتحقق من صحتها لتقدير حجم النيوكليوتيدات خارج الخلية البيورين ونوكليوسدس التي تنتجها النقي سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) الخلايا تحت الظروف ثقافة مختلفة . يتم تنفيذ الفصل الكروماتوغرافي من الأدينوزين 5'-الأدينوزين (AMP)، الأدينوزين (ADO) وإينوزين (INO) في RT على، عمود مرحلة عكس القائمة على السيليكا التي تستخدم للاحتفاظ مركب قطبي. يتضمن الأسلوب الطور المتحرك الثنائية، والتي تتكون من خلات الأمونيوم 7 مم والأسيتونتريل مع معدل التدفق من 1.00 مل / دقيقة. ورصدت eluates باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية الثنائي الضوئي صفيف وضعت في 260 نانومتر. يتم إنشاء منحنى المعايرة القياسية لحساب المعادلة لتقدير تحليلي من كل مركب البيورين. ثم يتم تنفيذ نظام مراقبة، والحصول على البيانات وتحليلها. تطبيق هذا البروتوكول، وAMP، INO وادو أزل في 7 و 11 و 11.9 دقيقة، على التوالي، ووقت التشغيل الكلي لكل عينة هو 20 دقيقة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أنواع الخلايا وخطوط الخلايا (على حد سواء تعليق وتمسكا) مختلفة، وذلك باستخدام وسائل الإعلام ثقافة مثل المصفوفة. من مزايا وسهولة وسرعة إعداد العينات واشتراط وجود كمية صغيرة من طاف للتحليل. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام وسيلة خالية من المصل يسمح تخطي الخطوة البروتين هطول الأمطار مع الأسيتونتريل أن يؤثر على تركيز النهائي من مركبات البيورين. واحد من أوجه القصور في طريقة هو الشرط العمود موازنة تشغيل قبل كل عينة تشغيل واحد، مما يجعل وقت التشغيل الكلي للتجربة أطول ومنع التطبيقات فحص عالية الإنتاجية.
Introduction
الأدينوزين (ADO) هو نوكليوزيد البيورين مع جزيء الأدينين تعلق على الريبوز السكر جزيء شاردة من خلال رابطة غليكوسيدية. عندما تكون موجودة في البيئة خارج الخلية، لأنه يحمي الخلايا من التلف المفرط بفعل الجهاز المناعي. وقد تم تسليط الضوء على هذا الدور باستخدام نماذج مختلفة من المرض، مثل التهاب القولون 1، 2 من داء السكري، والربو 3، 4 تعفن الدم، والإصابة الدماغية 5. واحدة من المهام الرئيسية ADO هو تثبيط الاستجابات المناعية في المكروية الورم، والمساهمة في الورم التهرب المناعة 6. لهذا السبب، فإن الآليات التي تشارك في تكوين ADO وإشارات ذات أهمية علاجية كبيرة 7.
مستويات ADO في المكروية الأنسجة منخفضة نسبيا في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، وبالتأكيد دون عتبة حساسية الخلايا المناعية. ومع ذلك، أثناء نقص الأكسجين، ونقص التروية، والتهاب، والعدوى، التمثيل الغذائيالتوتر وتحول ورم أنها تزيد بسرعة 8. مستويات ADO خارج الخلية مرتفعة في الاستجابة لإشارات تشويش الأنسجة لها وظيفة مزدوجة: أن يقدم إصابة الأنسجة بطريقة autocrine ونظير الصماوي وتوليد استجابات الأنسجة التي يمكن أن ينظر إليه عادة باعتباره سيتوبروتيكتيفي.
خارج الخلية ADO يمكن تشكيلها من خلال مجموعة متنوعة من الآليات، التي تشمل الإفراج عن حجرات داخل الخلايا بوساطة النقل نوكليوزيد 9 أو تراكم بسبب تدهور ضعاف تديرها نازعة أمين الأدينوزين. المسار الرئيسي مما يؤدي إلى زيادة مستويات الخلية ADO ينطوي على عمل سلسلة من ectonucleotidases، وهي غشاء المرتبطة ectoenzymes توليد ADO بواسطة phosphohydrolysis من النيوكليوتيدات صدر من الخلايا الميتة أو التي تحتضر. يمضي هذا المسار من خلال عمل متتابعة من CD39 (ثلاثي ectonucleoside diphosphohydrolase-1) الذي يحول الخلية أدينوسين ثلاثي الفوسفات 5'-(ATP) أو الأدينوزين 5'-ثنائي الفوسفات (ADP) إلى الأدينوزين 5'-الأدينوزين (AMP) وCD73 (5'-نوكليوتيداز)، والذي يحول AMP إلى ADO 10.
يتسبب خارج الخلية ADO الاستجابات الفسيولوجية ملزمة لأربعة الغشاء ADO المستقبلات، وهي A1، A2A، A2B وA3. كل مستقبل له الانتماءات المختلفة لادو وتوزيع الأنسجة محددة. جميع المستقبلات لها سبعة المجالات عبر الغشاء، وهي G-بروتين بالإضافة إلى الخلايا البروتينات ملزم GTP (البروتينات G)، التي يمكن أن تحدث (البروتين غس) أو تمنع (غي البروتين) النشاط محلقة الأدينيلات و، في وقت لاحق، والإنتاج من المخيم داخل الخلايا. لذلك، والتغيرات في هيولي تأثير مستويات المخيم على الخلايا نشاط البروتين كيناز خلال الاستجابات الفسيولوجية 11. في ظل الظروف الفسيولوجية ADO خارج الخلية أقل من 1 ميكرومتر، والتي يمكن تفعيلها بشكل عشوائي A1، A2A ومستقبلات A3. ومع ذلك، فإن تفعيل A2B سلالة يتطلب أعلى بكثيرتركيزات نوكليوزيد، مثل تلك التي تم إنشاؤها في ظل ظروف الفيزيولوجية المرضية. بدلا من ذلك، ADO خارج الخلية يمكن أن يتحلل إلى إينوزين (INO) من خلال نازعة أمين الأدينوزين (ADA) وCD26، وهو بروتين ADA كومبليكسينج توطين ADA على سطح الخلية. والاحتمال الآخر هو أن ADO وداخليا من قبل الخلية من خلال الناقلين equilibrative نوكليوزيد (ENT) وفسفرته إلى AMP التي كتبها ADO بروتين كيناز 12،13.
والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف الطريقة التحليلية المرحلة العكسية عالية الأداء اللوني السائل (RP-HPLC) لتحديد في شوط واحد وAMP الركيزة وادو المنتجات وINO، والتي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا الليمفاوية الإنسان. تم الحصول على تجربتنا في البداية باستخدام خلايا من سرطان الدم الليمفاوي (CLL) المرضى المزمنين، والتي تتميز التوسع في عدد السكان ناضجة من الخلايا الليمفاوية CD19 + / CD5 + B معربا جوهري CD39 14،15. أظهرنا ما يقرب من 30٪من CLL المرضى تعبر عن إنزيم خارجي CD73 وأن هذا النمط الظاهري يرتبط بسوء التشخيص 16. هذا حيوانية من خلايا اللوكيميا شارك في التعبير عن CD39 و CD73 يمكن أن تنتج بنشاط ADO خارج الخلية من ADP و / أو AMP. حضن مسبق من CD73 + CLL الخلايا مع α، β-الميثيلين-ADP (APCP)، مثبط معروفة من CD73 النشاط الأنزيمي، وكتل تماما التوليف ADO خارج الخلية يؤكد أن CD73 يمثل انزيم زجاجة الرقبة من أن سلسلة 16.
خلايا CLL أيضا التعبير عن ADA وADA كومبليكسينج البروتين CD26، التي تعتبر مسؤولة عن تحويل ADO إلى INO. باستخدام مثبطات ADA محددة، مثل erythro-9- (2-هيدروكسي-3-نونيل) أنا wiadenine (احنا) هيدروكلوريد وdeoxycoformycin (DCF)، فمن الممكن لمنع تدهور ADO خارج الخلية إلى INO. وعلاوة على ذلك، المعالجة مع مثبط ADA في تركيبة مع ديبيريدامول، الذي يمنع النقل نوكليوزيد، ويعزز تراكم ADO في الخليةsupernatants.
لقد امتدت بعد ذلك هذا البروتوكول إلى الخلايا المشتقة من الأنساب الأخرى، بما في ذلك الخلايا اللمفية تي وخلايا الدم النخاعي، مؤكدا إنتاج ADO تعتمد على CD73. وتشير هذه النتائج إلى أن هذا البروتوكول HPLC هو تنوعا للغاية، وأنه يمكن تطبيقها على الأنساب مختلفة من الخلايا ولظروف ثقافة مختلفة (الشكل 1).
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للآلية الأنزيمية مسؤولة عن إنتاج ADO خارج الخلية. أدينوسين ثلاثي الفوسفات 5'-(ATP) و / أو الأدينوزين 5'-ثنائي الفوسفات (ADP) يمكن أن يتحلل من CD39 إلى الأدينوزين 5'-الأدينوزين (AMP)، الذي بدوره تحويلها من قبل CD73 في الأدينوزين نوكليوزيد (ADO). مرة واحدة ويتم إنتاج ADO في الفضاء خارج الخلية، قد أعد إدخال الخلية من خلال الناقلين نوكليوزيد (ENT)، يتم تحويلها إلى إينوزين (INO) أوربط أنواع مختلفة من المستقبلات P1 ADO. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها هنا يسمح لتقييم نشاط CD39 / CD73 الآلات adenosinergic في وسائل الإعلام ثقافة خلية من خلايا اللوكيميا الإنسان النقاء. من خلال هذا الأسلوب HPLC يمكننا متابعة وكميا قياس الجيل الأنزيمي ادو (CD73 التي تعتمد على)، وتدهور لاحقا لإنو (CD26 / ADA التابعة). استخدام مثبطات إنزيم يسمح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل Associazione الإيطالية يسر كل من Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what’s new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
