HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
Bu yöntem, bir duyarlı, spesifik, güvenilir ve tekrarlanabilir bir ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) deneyi geliştirilmiştir ve farklı kültür koşulları altında, saflaştırılmış kronik lenfositik lösemi tarafından üretilen hücre dışı purin nükleotitleri ve nükleosidler (CLL) hücre ölçümü için geçerli tarif . kromatografik adenozin 5'-monofosfat ayrılması (AMP), adenosin (ADO) ve inosin (INO) polar bileşik tutulması için kullanılan bir silika olan, ters-fazlı sütun üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Yöntem / dk 1.00 ml bir akış oranı ile 7 mM amonyum asetat ve asetonitril oluşan bir ikili mobil faz içerir. yıkama sıvıları, 260 nm'de ayarlanmış bir Fotodiyot Dizi UV detektör kullanılarak izlenir. Standart kalibrasyon eğrisi her pürin bileşiğin analitik ölçümü için denklemi hesaplamak için oluşturulur. Sistem kontrolü, veri toplama ve analizi, daha sonra gerçekleştirilir. Bu protokolü uygulayarak, AMP INO ve ADO, sırasıyla, 7, 11 ve 11.9 dakika ile elüt ve her bir örnek için toplam çalışma süresi 20 dakikadır. Bu protokol, matris olarak bir kültür ortamı kullanılarak, hücre tipleri ve hücre çizgileri (süspansiyon ve yapışık hem de) farklı tatbik edilebilir. avantajlar kolay ve hızlı bir numune hazırlığı ve analiz için yüzer bir miktar ihtiyacı vardır. Bundan başka, bir serum barındırmayan ortam içinde kullanımı Asetonitril ile protein tortulaşması atlayarak olanak sağlayan etkiler pürin bileşiklerin nihai konsantrasyonu. yöntemin sınırlamaları biri tek tek her numune çalışması önce çalıştırmak dengeleme sütun gereksinimi, uzun deney toplam çalışma süresini yapma ve yüksek verimli tarama uygulamaları engelliyor.
Introduction
Adenosin (ADO), bir glikosidik bağ ile riboz şeker molekülü grubuna bağlı bir adenin molekülü ile bir purin nükleosid olan. Tüm hücre dışı ortamda mevcut olan bağışıklık sisteminin harekete aşırı zarar hücreleri korur. Bu rol, böyle kolit 1, diyabet 2, astım 3, sepsis 4, ve iskemik hasar 5 gibi farklı hastalık modelleri kullanılarak vurgulanmıştır. Ana ADO fonksiyonlarından biri tümör immün kaçırma 6 katkıda tümör mikro-bağışıklık tepkilerinin inhibisyonudur. Bu nedenle, ADO oluşumu ve sinyalizasyon dahil mekanizmalar ölçüde terapötik ilgi 7 vardır.
doku çevresinde ADO düzeyleri, normal fizyolojik koşullar altında ve kesinlikle immün hücrelerin duyarlılığı eşiğinin altında nispeten düşüktür. Bununla birlikte, hipoksi sırasında, iskemi, enflamasyon, enfeksiyon, metabolikStres ve tümör dönüşümü hızla 8 artış. otokrin ve parakrin şekilde doku hasarını bildirmek ve genellikle hücre koruyucu olarak görülebilir doku tepkileri üretmek için: doku bozucu sinyallerine karşılık olarak, yüksek hücre dışı ADO düzeyleri iki işlevi vardır.
Hücre dışı ADO için adenosin deaminaz işletmesinde bozulmuş bozulma nükleosid taşıyıcı 9 veya birikiminin aracılık ettiği hücre içi bölmelerden salım mekanizmalarının, çeşitli yoluyla oluşturulabilir. artmış hücre dışı ADO seviyelere giden ana yol ölü veya ölmekte hücrelerden salınan nükleotidlerin phosphohydrolysis ADO üreten membran bağlantılı ectoenzymes olan ectonucleotidases, bir kaskad bir işlem içerir. Bu yol CD39 sıralı hareket ilerler (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase-1) ekstraselüler adenozin 5'-trifosfat dönüştürür (ATP) veya AMP 10 ADO'ya dönüştürür adenozin 5'-monofosfat (AMP) ve CD73 (5'-nükleotidaz) adenozin 5'-difosfat (ADP),.
Hücre dışı ADO dört transmembran ADO reseptörleri, yani A1, A2a, A2b ve A3 bağlanarak fizyolojik tepkileri ortaya koyar. Her bir reseptör Ado ve spesifik doku dağıtımı için farklı afinitelere sahiptir. Tüm reseptörleri yedi transmembran ve G-proteini, hücre içi GTP bağlayıcı proteinler (G proteinleri) birleştirilmiş, bu neden (G proteini) ya da daha sonra, hücre içi cAMP üretimini inhibe (Gi proteini) adenilat siklaz aktivitesi ve yararlanılabilir. Bu nedenle, fizyolojik yanıtlar sırasında 11 hücre içi protein kinaz aktivitesine sitoplazmik cAMP seviyelerinin etkisi değişir. Fizyolojik koşullar altında, hücre dışı ADO gelişigüzel A1, A2A ve A3 reseptörlerini aktive edebilen 1 uM, altındadır. Ancak, A2B alt tipi aktivasyonu önemli ölçüde daha yüksek gerektirirBu patofizyolojik koşullarda üretilenler gibi nükleosit konsantrasyonları. Alternatif olarak, hücre dışı ADO adenozin deaminaz (ADA) ve CD26, hücre yüzeyinde ADA lokalize bir ADA kompleks protein tarafından inosin (INO) bozulmuş olabilir. Diğer bir olasılık, ADO ADO kinaz proteinin 12,13 tarafından AMP equilibrative nükleosid taşıyıcı (KBB) ve fosforile yoluyla hücre tarafından içselleştirilir olmasıdır.
Bu protokolün amacı insan lenfositleri tarafından oluşturulan, tek bir kerede alt-tabaka AMP ve ürünler ADO ve INO ölçmek için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) analitik bir yöntem tanımlamaktır. Tecrübemiz ilk kurucu CD39 14,15 eksprese CD19 + / CD5 + B lenfositlerin olgun bir popülasyonunda genişleme ile karakterize edilen kronik lenfositik lösemi (CLL) hastanın hücreleri kullanılarak elde edilmiştir. Biz yaklaşık% 30 gösterdiKLL hastaları CD73 ectoenzyme ifade ve bu fenotip kötü prognoz 16 ile ilişkilidir. CD39 ve CD73 ko-eksprese eden lösemi hücrelerinin bu alt grubu aktif ADP ve / veya AMP den hücre dışı ADO üretebilir. A ile CD73 + CLL hücreleri önceden bekletme, β-metilen-ADP (APCP), CD73 enzimatik aktivitesinin bilinen bir önleyicisi, tamamen bloke hücre dışı ADO sentezi CD73 bu kaskadın 16 şişe boynu enzimi temsil ettiği teyit etmektedir.
KLL hücreleri de INO içine ADO dönüşümünden sorumlu olan ADA ve ADA kompleks protein CD26, ifade eder. Bu eritro-9 gibi belirli ADA inhibitörleri kullanarak (2-Hidroksi-3-nonil, i) wiadenine (EHNA) hidroklorür ve deoksikoformisin (DCF), bu INO ekstraselüler ADO bozulmasını engellemek mümkündür. Ayrıca, dipiridamol ile bir arada bir ADA inhibitörü ile ön-muamele, bloklar nükleosid taşıyıcılar bu, hücre ADO birikimini arttıransüpernatantlar.
Daha sonra CD73-bağımlı ADO üretimini teyit T lenfositler ve miyeloid hücreler de dahil olmak üzere, diğer soylar, elde edilen hücreler için bu protokolü genişletmiştir. Bu bulgular, bu HPLC protokolü çok yönlüdür ve (Şekil 1), farklı hücre soyları ve farklı kültür koşullarında tatbik edilebilir olduğunu göstermektedir.
Hücre-dışı ADO üretiminden sorumlu olan enzimatik mekanizmaya Şekil 1. şematik temsili. Adenosin 5'-trifosfat (ATP) ve / veya adenozin 5'-difosfat (ADP), adenosin 5'-monofosfat (AMP) 'e CD39 tarafından parçalandığı ulaşılabilen bu da nükleosid adenosin (ADO) içerisine CD73 ile dönüştürülür. ADO hücre dışı alan üretilir sonra, nükleosid taşıyıcı (KBB) aracılığıyla hücreyi tekrar girebilecektir, inosin dönüştürülebilir (INO) ya daP1 ADO reseptörlerinin farklı türde bağlanırlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol saflaştınlmış insan lösemi hücreleri, hücre kültür ortamı içinde CD39 / CD73 adenozinerjik makine etkinliğini değerlendirmek için izin verir. Bu HPLC yöntemi ile, takip ve kantitatif ADO (CD73-bağımlı) ve INO olan sonraki bozulma (CD26 / ADA bağlıdır) enzımatik oluşma ölçebilir. enzim inhibitörlerinin kullanılması protokolü kontrol etmek ve iç kontrol etmenizi sağlar. Bu protokolün avantajları ve yenilikleri de ii) kültür ortamı az miktarda gerektirir ve ii…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Associazione Italiana Ricerca Yengeç (IG # 12754) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what’s new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
