HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

Summary

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

Abstract

この方法は、異なる培養条件下で精製した慢性リンパ球性白血病（CLL）細胞によって産生される細胞外プリンヌクレオチド及びヌクレオシドの定量化のために開発、検証、敏感な特定の、信頼性が高く再現可能な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）アッセイを記載します。アデノシン5'-一リン酸（AMP）、アデノシン（ADO）とイノシン（INO）のクロマトグラフィー分離は、極性化合物の保持のために使用されるシリカベースの逆相カラム上でRTで行われます。方法/分1.00 mlに、流速と7mMの酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルから成る2成分移動相を含みます。溶出液を260nmで設定フォトダイオードアレイUV検出器を用いて監視されます。標準検量線は、各プリン化合物の分析的定量化のための方程式を計算するために生成されます。システム制御、データ収集および分析が次に実施されます。このプロトコルを適用すると、AMP、INOとADOは、それぞれ、7、11および11.9分で溶出し、各試料の総実行時間は20分です。このプロトコルは、マトリックスとして培地を使用して、異なる細胞型および細胞株（懸濁および接着の両方）に適用されてもよいです。利点は、簡単かつ迅速に試料調製及び分析のために上清の少量の要求です。また、無血清培地の使用は、その影響のプリン化合物の最終濃度をアセトニトリルによるタンパク質沈殿のステップをスキップできます。この方法の制限の1つは、より長い実験の合計実行時間を製造し、ハイスループットスクリーニング適用を防ぐ、各単一のサンプルのランの前に平衡化カラムをランの要件です。

Introduction

アデノシン（ADO）は、グリコシド結合を介してリボース糖の分子部分に結合したアデニン分子とプリンヌクレオシドです。ときに細胞外環境中に存在し、それは、免疫系の作用によって過度の損傷から細胞を保護します。この役割は、大腸炎^1、糖尿病^2、喘息^3、敗血症^4、及び虚血性損傷⁵のような異なる疾病モデルを使用して強調されています。メインADO機能の一つは、腫瘍免疫回避⁶に貢献し、腫瘍微小環境における免疫応答の阻害です。この理由のために、ADO形成およびシグナル伝達に関与するメカニズムは、かなりの治療上の関心⁷です。

ADO組織微小環境中のレベルは、正常な生理学的条件下では相対的に低く、確かに免疫細胞の感度閾値以下。しかし、低酸素症、虚血、炎症、感染症、代謝中ストレスや腫瘍変換が、彼 ​​らは急速に^8を高めます。オートクリンおよびパラクリン方法で、組織の損傷を報告するために、一般的に細胞保護とみなすことができる組織応答を生成する：組織摂動信号に応答して上昇した細胞外ADOレベルは二重の機能を持っています。

細胞外ADOが原因アデノシンデアミナーゼによって操作損なわ分解のヌクレオシド輸送体⁹または蓄積によって媒介される細胞内コンパートメントからの放出を含む機構の様々なを通じて形成することができます。増加した細胞外ADOレベルに至る主な経路は、死んでいるか死にかけている細胞から放出されたヌクレオチドのphosphohydrolysisによってADOを生成する膜関連ectoenzymesあるectonucleotidases、のカスケードの作用を伴います。この経路は、CD39の連続作用を介して進行する（ectonucleoside三リン酸ジホ-1）細胞外アデノシン5'-三リン酸に変換します（ATP）またはAMPは^10を ADOに変換アデノシン5'-一リン酸（AMP）およびCD73（5'-ヌクレオチダーゼ）のアデノシン5'-二リン酸（ADP）、。

細胞外ADOは4貫通ADOの受容体、すなわちA1、A2A、A2BおよびA3に結合することによって、その生理学的応答を誘発します。各受容体は、ADOおよび特定の組織分布に対して異なる親和性を持っています。すべての受容体は、7回膜貫通ドメインを有し、（Gタンパク質）を誘導または阻害することができる細胞内のGTP結合タンパク質（Gタンパク質）に結合したGタンパク質（GIタンパク質）アデニル酸シクラーゼ活性と、続いて、細胞内cAMPの産生です。生理学的反応¹¹中の細胞内タンパク質キナーゼ活性のため、細胞内cAMPレベルの変化が影響。生理学的条件下で細胞外ADOは無差別A1、A2AおよびA3受容体を活性化することができ、1μM、以下です。しかし、A2Bサブタイプの活性化は、かなり高い必要このような病態生理学的条件の下で生成されるようなヌクレオシドの濃度は、。あるいは、細胞外ADOは、アデノシンデアミナーゼ（ADA）とCD26、細胞表面上のADAを局在ADA錯化タンパク質によってイノシン（INO）に分解することができます。別の可能性は、ADOがADOキナーゼタンパク質^12,13によってAMPにequilibrativeなヌクレオシドトランスポーター（ENT）およびリン酸化を介して細胞によって内在化されることです。

このプロトコルの目的は、ヒトのリンパ球によって生成されるように、単一の実行で基板AMP及び製品ADOとINOを定量化するために、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の分析法を記載することです。我々の経験は、最初に構成CD39 ^14,15を発現^する CD19 ⁺ / CD5 ⁺ Bリンパ球の成熟集団の増殖によって特徴付けられる慢性リンパ球性白血病（CLL）患者由来の細胞を用いて得ました。我々は、約30％を示しました。CLL患者のCD73の細胞外酵素を発現し、この表現型は予後不良¹⁶と相関しています。 CD39およびCD73を共発現する白血病細胞のこの亜集団は、積極的にADPおよび/またはAMPから細胞​​外ADOを生成することができます。 α、βメチレン- ADP（APCP）、CD73酵素活性の既知の阻害剤とCD73 ⁺ CLL細胞、完全に遮断外ADO合成のプレインキュベーションは、CD73がそのカスケード¹⁶のボトルネック酵素を表していることを確認しました。

CLL細胞はまたINOへのADOの変換に関与しているADAおよびADA複合体形成タンパク質CD26を発現します。そのようなエリスロ-9-などの特定のADA阻害剤を用いて（2-ヒドロキシ-3-ノニル）Iはwiadenine（EHNA）塩酸塩およびデオキシコホルマイシン（DCF）、それはINOに外ADO劣化を阻止することが可能です。また、ジピリダモールと組み合わせて、ADA阻害剤での前処理は、ブロックヌクレオシドトランスポーターということは、細胞内のADOの蓄積を強化します上清。

それから、CD73依存ADOの生産を確認し、Tリンパ球および骨髄細胞を含む他の系統に由来する細胞に、このプロトコルを拡張しました。これらの知見は、このHPLCプロトコルは非常に汎用性があり、それは、異なる細胞系統に異なる培養条件（ 図1）に適用することができることを示唆しています。

図1 の細胞外ADOの産生を担う酵素機構の略図。アデノシン5'-三リン酸（ATP）および/ ​​またはアデノシン5'-二リン酸（ADP）は、アデノシン5'-一リン酸（AMP）へのCD39によって分解することができ、その今度は、ヌクレオシドアデノシン（ADO）にCD73によって変換されます。 ADOは、細胞外空間に生成されると、それは、ヌクレオシド輸送体（ENT）を介して細胞を再入力することができる、イノシンに変換する（INO）またはP1 ADO受容体の異なるタイプに特異的に結合する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

CLL血液試料を研究所のガイドライン及びヘルシンキ宣言に従って得られます。 CLL患者の血液サンプルから白血病リンパ球の1の単離ヘパリンナトリウム（グリーン・トップ）チューブ17内の血液サンプルを採取します。 RT 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で全血の3希釈：1にします。 密度勾配遠心分離により血液試料から末梢血単核細胞（PBMC）を精製します…

Representative Results

代表的なCLL患者から新たに精製したPBMC中の白血病細胞の割合（％）を評価するために、細胞を抗CD19および抗CD5抗体でマークされています。 図3の左側のパネルには、生きた細胞に選択ゲートと細胞蛍光ドットプロットを表している。 図3は、（中央パネル）の前にCLL患者からのPBMCの一例を示し、（右パネル）B細胞の精製後。 <p class="jove_co…

Discussion

ここで説明するプロトコルは、精製されたヒト白血病細胞からの細胞培養培地中のCD39 / CD73アデノシン機械の活性を評価することを可能にします。このHPLC法を通して、私たちは以下の通りと定量的にADO（CD73依存）とINOへのその後の分解（CD26 / ADA依存）の酵素的生成を測定することができます。酵素阻害剤の使用は、プロトコルを制御するために、内部コントロールを有することを可能にし?…

Materials

Human blood
Milli-Q water	Millipore		double deionised water
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16	made in-house		mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC-labeled anti-CD5	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG	Invitrogen	11031
Phosphate-buffered saline (PBS)	Amresco	E404-200TABS	tablets
bovine serum albumin (BSA)	ID bio	1000-70	standard grade
isolation buffer			PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium	GIBCO	12055-091	liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-methylene-ADP (APCP)	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride	Sigma-Aldrich	E114	adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF)	Tocris	2033	adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dipyridamole	Sigma-Aldrich	D9766	nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC-grade
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721-1L	min. 37 %
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bürker cell counter	VWR	631-0920	hemocytometer
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET centrifuge tubes	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters	Sartorius Stedim Biotech	17821	membrane 0.2 µm
short thread vials	VWR	548-0029	1.5 ml/glass
micro-inserts	VWR	548-0006	0.1 ml/glass
screw caps	VWR	548-0085	9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column	Waters	186001344	5 µm, 4.6 x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column	Waters	186001323	5 µm, 4.6 x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module	Waters		HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector	Waters		UV detector
Waters Empower2 software	Waters