ВЭЖХ на основе анализа для мониторинга внеклеточного нуклеотидную / нуклеозид Метаболизм в человека хронический лимфолейкоз клеток
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
Этот метод описан чувствительный, специфический, надежный и воспроизводимый обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) анализа, разработанной и апробирован для количественного определения внеклеточных пуриновых нуклеотидов и нуклеозиды, полученные очищенном хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) клеток при различных условиях культивирования , Хроматографическое разделение аденозин-5'-монофосфат (АМФ), аденозин (АДО) и инозин (ИНО) проводят при комнатной температуре на, обращенно-фазовой колонке на основе диоксида кремния, который используется для полярного удержания соединения. Способ включает в себя двоичную подвижную фазу, которая состоит из 7 мМ ацетата аммония и ацетонитрила, при скорости потока 1,00 мл / мин. Элюаты контролируют с помощью УФ-детектора Фотодиод установку настроек при длине волны 260 нм. Стандартной калибровочной кривой, генерируется для вычисления уравнения для аналитического определения количества каждого пуринового соединения. Система управления, сбора и анализа данных, затем выполняется. Применяя этот протокол, А.М.P, ИНО и АДО вымывается на 7, 11 и 11,9 мин соответственно, а общее время выполнения для каждого образца составляет 20 мин. Этот протокол может быть применен для различных типов клеток и клеточных линий (как подвесные и прилипшие), с использованием культуральной среды в качестве матрицы. Преимущества легко и быстро пробоподготовки и требование небольшого количества супернатанта для анализа. Кроме того, использование сыворотки среде позволяет пропускать стадию осаждения белка с ацетонитрилом, который влияет на конечную концентрацию пуриновых соединений. Одним из недостатков этого метода является требование колонки уравновешивающим выполняется перед каждым один прогон образца, в результате чего общее время выполнения эксперимента больше и предотвращение приложений скрининга высокой пропускной способностью.
Introduction
Аденозин (ADO) представляет собой пуриновый нуклеозид с молекулой-аденин прикрепленной к молекуле рибозы фрагмента сахара через гликозидной связи. Когда они присутствуют во внеклеточной среде, он защищает клетки от чрезмерного повреждения под действием иммунной системы. Эта роль была подчеркнута использованием различных моделей заболеваний, таких как колит 1, сахарный диабет 2, астма 3, сепсис 4 и ишемического повреждения 5. Одной из главных функций ADO является ингибирование иммунного ответа у опухоли микроокружения, способствуя опухоли иммунной уклонением 6. По этой причине, механизмы , участвующие в формировании восклицания и сигнализации представляют значительный терапевтический интерес 7.
ADO уровни в микросреде ткани являются относительно низкими в нормальных физиологических условиях, и, безусловно, ниже порога чувствительности иммунных клеток. Тем не менее, при гипоксии, ишемии, воспаление, инфекция, метаболическийстресс и трансформация опухоли быстро растут 8. Повышенные уровни внеклеточного ADO в ответ на сигналы ткани-возмущающих имеют двойную функцию: сообщать повреждение тканей в аутокринном и паракринной образом и генерировать ответы тканей, которые обычно можно рассматривать как Цитопротекторное.
Внеклеточный АДО может быть сформирован с помощью различных механизмов, которые включают высвобождение из внутриклеточных , опосредованных нуклеозидов транспортеров 9 или накопления из – за нарушенного деградации эксплуатируемых аденозиндезаминазы. Основной путь, ведущий к увеличению внеклеточного АДО уровней включает в себя действие каскада ectonucleotidases, которые связаны мембранные эктоэнзимов генерирующие ADO путем phosphohydrolysis нуклеотидов, освобожденных из мертвых или умирающих клеток. Этот путь проходит через последовательного действия CD39 (ectonucleoside трифосфат diphosphohydrolase-1), который преобразует внеклеточного аденозин-5'-трифосфата (АТФ) или аденозин 5'-дифосфат (АДФ) с аденозин 5'-монофосфата (AMP) и CD73 (5'-нуклеотидазе), который преобразует AMP в ADO 10.
Внеклеточной ADO вызывает свои физиологические реакции путем связывания с четырьмя трансмембранных рецепторов ADO, а именно A1, A2A, A2B и А3. Каждый рецептор имеет различные сродством к АДО и специфическим распределением ткани. Все рецепторы имеют семь трансмембранных доменов, и являются G-белок, соединенный с внутриклеточными ГТФ-связывающих белков (G белки), которые могут индуцировать (белок Гс) или ингибируют (Gi белка) активность аденилатциклазы и, в дальнейшем, производство внутриклеточного цАМФ. Таким образом, изменения в цитоплазме влияния уровней цАМФ на внутриклеточный активности протеинкиназы во время физиологических реакций 11. В физиологических условиях внеклеточного АДО ниже 1 мкМ, который может активировать без разбора A1, A2A и рецепторы A3. Тем не менее, активация A2B подтипа требует значительно выше,Концентрации нуклеозида, такие как те, которые генерируются в патофизиологических условиях. В качестве альтернативы, внеклеточный АДО может разлагаться до инозина (ИНО) путем аденозиндезаминазы (ADA) и CD26, в АДА комплексообразующего белка локализирующем ADA на поверхности клетки. Другая возможность состоит в том, что ADO интернализируется клеткой через equilibrative нуклеозидов транспортеров (ЛОР) и фосфорилируется до АМФ по АДО киназы белка 12,13.
Целью данного протокола является описание аналитического метода обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) для количественного определения в одном запуске АМП субстрат и продукты ADO и INO, а порождена лимфоцитов человека. Наш опыт был первоначально получен с использованием клеток от хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) пациентов, которые характеризуются расширением зрелого населения CD19 + / CD5 + B – лимфоцитов , экспрессирующих CD39 конститутивно 14,15. Мы показали около 30%ХЛЛ пациенты выражают ectoenzyme CD73 и что этот фенотип коррелирует с плохим прогнозом 16. Это субпопуляции лейкозных клеток коэкспрессирующей CD39 и CD73 может активно продуцируют внеклеточный ADO из АДФ и / или AMP. Преинкубация CD73 + клеток ХЛЛ с а, β-метилен-АДФ (APCP), известный ингибитор ферментативной активности CD73, полностью блокирует синтез внеклеточного АДО , подтверждающий , что CD73 представляет собой узкость фермент этого каскада 16.
ХЛЛ клетки также выражают ADA и ADA комплексообразования белка CD26, которые отвечают за превращение в ADO ИНО. Используя специфические ингибиторы ADA, такие как эритро-9- (2-гидрокси-3-нонил) Я wiadenine (EHNA) гидрохлорид и deoxycoformycin (DCF), можно блокировать внеклеточный деградацию СУЕТЫ в ИНО. Кроме того, предварительная обработка ингибитором ADA в сочетании с дипиридамолом, который блокирует нуклеозидов транспортеров, усиливает накопление в клетке ADOСупернатанты.
Мы затем распространили этот протокол в клетки, полученные из других родов, в том числе Т-лимфоцитов и миелоидных клеток, подтверждающих CD73-зависимого производства ADO. Эти данные позволяют предположить , что этот протокол ВЭЖХ является универсальным и что он может быть применен к дифференцировки различных клеток , и в различных условиях культивирования (рисунок 1).
Рисунок 1. Схематическое изображение ферментативного механизма отвечает за внеклеточного АДО. Аденозин – 5'-трифосфата (АТФ) , и / или аденозин 5'-дифосфат (АДФ) может разлагаться под действием CD39 на аденозин 5'-монофосфат (АМФ), который в свою очередь, преобразуется в CD73 нуклеозида аденозина (ADO). После того, как АДО производится во внеклеточном пространстве, он может повторно ввести клетку через нуклеозидов транспортеров (ЛОР), быть превращено в инозин (ИНО) илисвязываются с различными типами рецепторов P1 ADO. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, позволяет оценить активность CD39 / CD73 adenosinergic техники в среде для культивирования клеток из очищенных лейкозных клеток человека. С помощью этого метода ВЭЖХ мы можем следовать и количественно измерить ферментативную поколение ADO (CD73-зависимых) и его последующе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Associazione Italiana Ricerca (IG Рак # 12754).
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what’s new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
