HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
이 방법은 민감하고 특이 신뢰성 및 재현성을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC) 분석을 개발하여 다양한 배양 조건 하에서 정제 만성 림프 구성 백혈병에 의해 생성 된 세포 외 퓨린 뉴클레오티드 및 뉴 클레오 시드 (CLL) 세포의 정량화 검증 설명 . 크로마토 그래피 아데노신 5'- 모노 포스페이트의 분리 (AMP), 아데노신 (ADO) 이노신 (INO)의 극성 화합물의 보존에 사용되는 실리카 계, 역상 컬럼상에서 RT에서 수행된다. 방법 / 분 1.00 mL의 유속으로 7mm의 암모늄 아세테이트 및 아세토 니트릴로 구성된 이진 이동상을 포함한다. 용출액은 260 nm에서 설정된 광 다이오드 어레이 UV 검출기를 이용하여 모니터링된다. 표준 검량선 각 퓨린 화합물의 분석 정량 식을 계산하기 위해 생성된다. 시스템 제어, 데이터 획득 및 분석이 수행된다. 이 프로토콜을 적용, AMP, 및 ADO INO은 각각 7, 11, 11.9 분에서 용출하고, 각 샘플의 총 실행 시간은 20 분이다. 이 프로토콜은 매트릭스로서 배양 배지를 이용하여 세포 유형 및 세포주 (현탁액 및 부착 모두) 다른 적용될 수있다. 이점은 간단하고 빠른 샘플 준비 및 분석을 위해 상등액을 소량의 요구이다. 또한, 무 혈청 배지를 사용하는 아세토 니트릴과 단백질 침전 단계를 건너 허용하는 영향 퓨린 화합물의 최종 농도. 방법의 한계 중 하나는 각각의 단일 샘플을 실행하기 전에 실행 평형 열의 요건 이상 실험의 총 동작 시간을 결정하고 높은 처리량 스크리닝 응용을 방지한다.
Introduction
아데노신 (ADO)가 글리코 시드 결합을 통해 리보스 당 분자 잔기에 부착 된 아데닌 분자와 퓨린 뉴 클레오 사이드이다. 되면 세포 외 환경에 존재하는, 상기 면역계의 작용에 의해 과도한 손상으로부터 세포를 보호한다. 이 역할은 예 1 대장염, 당뇨병이 천식 3 패혈증 4, 허혈 5와 같은 다른 질병 모델을 사용하여 강조되어왔다. ADO 주요 기능 중 하나는 종양 면역 회피 6에 기여 종양 미세 환경의 면역 반응을 억제한다. 이러한 이유로, ADO 형성과 관련된 시그널링 메커니즘은 상당한 치료 학적 이익 (7)이다.
조직의 미세 ADO 수준은 정상적인 생리 조건 하에서 확실하게 면역 세포의 감도 임계 값보다 상대적으로 낮다. 그러나 동안 저산소증, 허혈, 염증, 감염, 대사스트레스와 종양의 변화는 빠르게 팔을 높일 수 있습니다. 분비하고 분비 방법으로 조직 손상을보고하고 세포 보호 일반적으로 볼 수있는 조직 반응을 생성하기 위해 : 조직 교란 신호에 응답하여 상승 된 세포 수준 ADO는 이중 기능을 갖는다.
세포 외 ADO 때문에 아데노신 데 아미나가 운영하는 장애인 저하의 뉴 클레오 시드 수송 9 축적에 의해 매개 세포 내 구획에서 방출을 포함 메커니즘의 다양한 통해 형성 될 수있다. 증가 된 세포 외 ADO 수준에 이르는 주요 경로는 죽었거나 죽어가는 세포에서 방출 뉴클레오티드의 phosphohydrolysis으로 ADO를 생성하는 막 관련 ectoenzymes 있습니다 ectonucleotidases의 캐스케이드의 활동을 포함한다. 이 경로는 CD39의 순차적 작용을 통해 진행한다 (ectonucleoside 포스페이트 diphosphohydrolase-1)의 세포 외 아데노신 5'- 삼인산 변환 (ATP) 또는 AMP 10 ADO로 변환 아데노신 5'- 모노 포스페이트 (AMP) 및 CD73 (5'- 뉴 클레오)의 아데노신 5'- 인산 (ADP).
세포 외 ADO 네 횡단 ADO 수용체, 즉 A1, A2A, A2B 및 A3에 결합하여 생리적 반응을 이끌어. 각 수용체는 ADO 특정 조직 분포에 대해 서로 다른 친화력을 보유하고 있습니다. 모든 수용체는 일곱 경막 도메인을 가지며 G 단백질 세포 GTP 결합 단백질 (G 단백질)에 결합 된, 즉 유도 (G 단백질), 또는 후속 적으로, 세포의 cAMP의 생산을 억제 (GI 단백질) 아데 닐 레이트 시클 라제 활성과 수있다. 따라서, 생리적 반응 (11) 중 세포 내 단백질 키나제 활성에 세포질 캠프 수준에 미치는 영향의 변화. 생리 학적 조건에서 세포 외 ADO 무차별 A1, A2A 및 A3 수용체를 활성화 할 수 있습니다 1 μM, 이하이다. 그러나, A2B 서브 타입의 활성은 상당히 높은 필요이러한 병태 생리 학적 조건에서 생성되는 것과 같이 뉴 클레오 사이드의 농도. 또한, 세포 외 ADO는 아데노신 데 아미나 제 (ADA)와 CD26, 세포 표면에 ADA 현지화 ADA 착화 단백질에 의해 이노신 (INO)로 저하 될 수 있습니다. 또 다른 가능성은 ADO는 ADO 키나아제 단백질 (12, 13)에 의해 AMP에 equilibrative 뉴 클레오 시드 수송 (ENT) 및 인산화를 통해 세포에 의해 내면화된다는 것이다.
이 프로토콜의 목적은 인간 림프구에 의해 생성 된 바와 같이, 하나의 실행에서, 기판 AMP 및 제품 ADO 및 INO 정량을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)의 분석 방법을 설명한다. 우리의 경험은 초기 구조적 14,15 CD39를 발현하는 CD19 + / CD5 + B 림프구의 성숙 인구의 팽창에 의해 특징 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자로부터의 세포를 사용하여 수득 하였다. 우리는 30 % 정도 나타났다CLL의 환자들은 CD73의 ectoenzyme을 표현하고 있음이 표현형은 불량한 예후 (16)와 상관 관계. CD39 및 CD73 공동 발현 백혈병 세포의이 하위 집단은 적극적으로 ADP 및 / 또는 AMP에서 세포 외 ADO를 생성 할 수 있습니다. α와 CD73 + CLL 세포의 예비 배양은 β 메틸렌 ADP (APCP) CD73 효소 활성의 공지 된 억제제 완전히 차단 외 ADO 합성 CD73가 캐스케이드 (16)의 보틀 넥 효소를 나타내는 것을 확인.
CLL 세포는 INO로 ADO의 변환에 대한 책임이 있습니다 ADA와 ADA 복합체 단백질 CD26를 표현한다. 예컨대 에리트로 -9- 특정 ADA 저해제를 사용하여 (2- 히드 록시 -3- 노닐)는 I wiadenine (EHNA) 염산염 deoxycoformycin (DCF)은 INO에 외 ADO 저하를 차단하는 것이 가능하다. 또한, 디피 리다 몰과 조합의 ADA 억제제와 전처리, 블록 뉴 클레오 시드 운송 것으로, 셀 ADO 축적을 강화상층 액.
우리는 그 다음 CD73에 의존 ADO 생산을 확인하는 T 림프구와 골수 세포를 포함한 다른 계통에서 파생 된 세포에이 프로토콜을 확장했다. 이러한 결과는 본 HPLC 프로토콜 매우 다재다능하고 (도 1) 상이한 세포 계통으로 상이한 배양 조건에 적용 할 수 있다는 것을 시사한다.
세포 외 ADO 생산을 담당하는 효소 기계 그림 1. 도식 표현. 아데노신 5'- 삼인산 (ATP) 및 / 또는 아데노신 5'- 인산 (ADP)은 아데노신 5'- 모노 포스페이트 (AMP)에 CD39에 의해 분해 될 수있는 다시 뉴 클레오 시드 아데노신 (ADO)로 CD73에 의해 변환된다. ADO는 세포 외 공간에서 생산되면,이 뉴 클레오 컨베이어 (ENT)를 통해 셀을 다시 입력 할 수 있고, 이노신으로 변환 (INO) 또는P1 ADO 수용체의 서로 다른 유형의 결합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 정제 된 인간의 백혈병 세포에서의 세포 배양 배지에서 CD39 / CD73 adenosinergic 기계의 활성을 평가할 수있게한다. 이 HPLC 방법을 통해 우리는 다음과 정량적으로 ADO (CD73-에 따라 다름) 및 INO에 그 이후의 저하 (CD26 / ADA에 따라 다름)의 효소 생성을 측정 할 수 있습니다. 효소 저해제를 사용하는 프로토콜을 제어하고 내부 제어를 할 수있다. 이 프로토콜의 장점과 참신 II)는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Associazione Italiana의 Ricerca Cancro (IG # 12754)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
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