Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy
Summary
We present guidelines for developing synthetic ‘chemical transducers’ that can induce communication between naturally unrelated proteins. In addition, detailed protocols are presented for synthesizing and testing a specific ‘transducer’ that enables a growth factor to activate a detoxifying enzyme and consequently, to regulate the cleavage of an anticancer prodrug.
Abstract
Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins that interact with each other and activate one other with high specificity. Synthetic agents that mimic the function of these proteins might therefore be used to generate unnatural signal transduction steps and consequently, alter the cell’s function. We present guidelines for designing ‘chemical transducers’ that can induce artificial communication between native proteins. In addition, we present detailed protocols for synthesizing and testing a specific ‘transducer’, which can induce communication between two unrelated proteins: platelet-derived growth-factor (PDGF) and glutathione-S-transferase (GST). The way by which this unnatural PDGF-GST communication could be used to control the cleavage of an anticancer prodrug is also presented, indicating the potential for using such systems in ‘artificial signal transduction therapy’. This work is intended to facilitate developing additional ‘transducers’ of this class, which may be used to mediate intracellular protein-protein communication and consequently, to induce artificial cell signaling pathways.
Introduction
Signaaltransductiewegen spelen een belangrijke rol in vrijwel elk celprocessen en de cel reageert snel te reageren op signalen uit de omgeving. 1 Deze trajecten worden vaak veroorzaakt door de binding van een signalerende molecule aan een extracellulaire receptor, hetgeen resulteert in activatie van intracellulaire enzymen. Amplificatie en vermeerdering van dit signaal in de cel wordt gemedieerd door de werking van signaaleiwitten die een netwerk van eiwit-eiwit interacties waarbij enzymen reversibel zijn geactiveerd met hoge specificiteit te vormen. Vanwege ontregeling van deze netwerken vaak leidt tot de ontwikkeling van kanker, is er veel belangstelling voor oprichting van 'signaaltransductie behandeling van kanker', 2 waarbij drugs zijn ontworpen om kwaadaardige signaalwegen verstoren geweest. We hebben onlangs voorgesteld een alternatieve benadering van transductie therapie die berust op het vermogen van geneesmiddelen om onnatuurlijke signaaltransductiewegen genereren signaal. <sup> 3 Met name zijn wij van mening dat door het ontwerpen van synthetische middelen die de functie van signaaleiwitten nabootsen, zou het mogelijk zijn om de functie van de cel indirect te moduleren. Bijvoorbeeld kunnen deze kunstmatige netwerken eiwitbiomarkers staat te splitsen enzymen die progeneesmiddelen activeren. Als alternatief kunnen deze signalering proteïne mimetica kunnen onnatuurlijke cel signaalwegen te activeren, wat resulteert in therapeutische effecten.
Om de uitvoerbaarheid van deze benadering tonen, hebben wij onlangs een synthetisch "chemisch transducer 4 dat bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF) maakt de splitsing van een kanker prodrug activeren door het activeren van glutathion-s-transferase (GST), wat niet zijn natuurlijke bindende partner. De structuur van deze 'transducer bestaat uit een anti-PDGF DNA aptameer dat is gemodificeerd met een tweewaardige remmer voor GST. Vandaar dit synthetische stof behoort tot een familie van moleculen met bindingsplaatsenverschillende eiwitten, 5-7 zoals chemische inductoren van dimerisatie (CID) 8-10 alsmede de zogenaamde eiwit-bindmiddel op basis van synthetische oligonucleotide-molecuul conjugaten. 11-21
De algemene beginselen van het ontwerpen van dergelijke systemen wordt hierin beschreven en gedetailleerde protocollen voor het synthetiseren en testen van de functie van dit 'transducer met gebruikelijke enzymatische assays worden voorzien. Dit werk ter vergemakkelijking ontwikkelen van aanvullende 'transducers' van deze klasse, die kunnen worden gebruikt om intracellulair eiwit-eiwit mediëren communicatie en dus aan kunstmatige cel signaalwegen induceren.
Figuur 1 beschrijft schematisch de werkingsprincipes van synthetische "chemische transducers 'dat onnatuurlijke eiwit-eiwit communicatie kan mediëren. In deze illustratie, een "chemische transducer, die synthetische bindmiddelen voor prot integreerteins I en II (bindmiddelen I en II), zodat het eiwit II katalytische activiteit van proteïne I, die niet de natuurlijke bindingspartner veroorzaken. Aangezien eiwit II, de omzetter verbindt de katalytische plaats van het enzym (eiwit I) en remt zijn activiteit (figuur 1, staat ii). De binding van de "transducer eiwit II echter bevorderen van de wisselwerkingen tussen bindmiddel I en het oppervlak van eiwitten II (figuur 1, staat iii) die zijn affiniteit richting eiwit I. de effectieve concentratie van minder Hierdoor de ' vrije 'transducer in de oplossing wordt gereduceerd, hetgeen leidt tot dissociatie van het transducer-eiwit I complex en reactivering van eiwit I (figuur 1, staat iv). Tezamen bieden deze stappen te markeren drie fundamentele uitgangspunten van het ontwerp van een efficiënte 'transducers': (1) een 'transducer' moet een specifieke binder hebben voor elk van de eiwit targets, (2) de interactie between bindmiddel II en eiwit II moet sterker dan de wisselwerking tussen bindmiddel I en I eiwit, en (3) binder I moet kunnen aangaan met het oppervlak van eiwitten II zijn. Dit laatste beginsel niet noodzakelijkerwijs dat bindmiddel ik alleen zou een hoge affiniteit en selectiviteit in de richting van eiwitten II hebben. In plaats daarvan is het gebaseerd op onze recente studies waaruit bleek dat het brengen van een synthetisch molecuul in de nabijheid van een eiwit waarschijnlijk interactie tussen deze moleculen en het oppervlak van het proteïne bevorderen. 19,22,23
Figuur 1:. Werkingsprincipes van "chemische transducers 'Wanneer de" chemische transductor "toegevoegd actief eiwit I (toestand i), het bindt aan de actieve site via bindmiddel I en remt zijn activiteit (state ii). In de aanwezigheid van eiwit II echter de ongebonden 'chemische transducer "interageert met eiwit II tot bindmiddel II, die interacties tussen bindmiddel I en het oppervlak van eiwitten II bevordert. Dit veroorzaakte bindmiddel I-eiwit II interactie vermindert de effectieve concentratie van bindmiddel I, wat leidt tot dissociatie van het 'transducer'-eiwit I complex en eiwit I reactivering (state iv). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Protocol
Representative Results
Discussion
We presented a method for designing and testing of a ‘chemical transducer’ that can induce artificial communication between two naturally unrelated proteins, GST and PDGF, without modifying the native proteins. The unnatural GST-PDGF communications could be detected in real time by using enzymatic assays that follow the changes in the activity of GST in the presence of the ‘chemical transducer’ and increasing the concentrations of PDGF. In addition to detecting the activation of GST by PDGF, these assays were used to fol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de Minerva Foundation, de HFSP Organisatie, en een European Research Council Grant (Starting Grant 338.265).
Materials
| 1-chloro-2,4-dinitrobenzene | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| Acetic acid | Bio Lab | 01070521 | |
| Acetnitrile | J.T.Baker | 9017-03 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Copper(II) Sulfate pentahydrate | Merck-Millipore | 102790 | |
| Dimethyl sulfoxide | Merck-Millipore | 802912 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-5A | |
| Ethacrynic acid | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
| Glutathione-s-transferase M1-1 | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| Magnesium Chloride | J.T.Baker | 0162 | |
| nitrate/nitrite colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 780001 | |
| Oligonucleotides | W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University | custom order | |
| PDGF-BB | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Desalting column | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Columns | |
| HPLC | Waters | 2695 separation module | |
| HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm) | |
| HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5μM, 10 mm × 50 mm) | |
| Plate reader | BioTek | synergy H4 hybrid |
References
- Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
- Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
- Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
- Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
- Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
- Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
- Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
- Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
- DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
- Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
- Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
- Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
- Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
- Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
- Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
- Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
- Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
- Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
- Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
- Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
- Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
- Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, ‘turn-on’ fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
- Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
- Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
- Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
- Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).
