Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

Summary

We present guidelines for developing synthetic ‘chemical transducers’ that can induce communication between naturally unrelated proteins. In addition, detailed protocols are presented for synthesizing and testing a specific ‘transducer’ that enables a growth factor to activate a detoxifying enzyme and consequently, to regulate the cleavage of an anticancer prodrug.

Abstract

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins that interact with each other and activate one other with high specificity. Synthetic agents that mimic the function of these proteins might therefore be used to generate unnatural signal transduction steps and consequently, alter the cell’s function. We present guidelines for designing ‘chemical transducers’ that can induce artificial communication between native proteins. In addition, we present detailed protocols for synthesizing and testing a specific ‘transducer’, which can induce communication between two unrelated proteins: platelet-derived growth-factor (PDGF) and glutathione-S-transferase (GST). The way by which this unnatural PDGF-GST communication could be used to control the cleavage of an anticancer prodrug is also presented, indicating the potential for using such systems in ‘artificial signal transduction therapy’. This work is intended to facilitate developing additional ‘transducers’ of this class, which may be used to mediate intracellular protein-protein communication and consequently, to induce artificial cell signaling pathways.

Introduction

Les voies de transduction du signal jouent un rôle important dans pratiquement tous les processus cellulaire et permettent à la cellule de répondre rapidement à des signaux environnementaux. ¹ Ces voies sont souvent déclenchées par la liaison d'une molécule de signalisation à un récepteur extracellulaire, ce qui se traduit par l' activation des enzymes intracellulaires. L'amplification et la propagation de ce signal dans la cellule est médié par la fonction des protéines qui forment un réseau d'interactions protéine-protéine dans lequel les enzymes sont activées de manière réversible avec une spécificité élevée de signalisation. Parce que la dysrégulation de ces réseaux conduit souvent au développement du cancer, il y a eu beaucoup d' intérêt pour l' établissement d'une «thérapie de signal de transduction du cancer ', ² dans lequel les médicaments sont conçus pour perturber les voies de signalisation malignes. Nous avons récemment proposé une approche alternative pour signaler la thérapie de transduction qui repose sur la capacité des médicaments pour générer anormales des voies de transduction du signal. <sup> 3 En particulier, nous pensons que par la conception d' agents synthétiques qui imitent la fonction des protéines de signalisation, il serait possible de moduler la fonction de la cellule indirectement. Par exemple, ces réseaux artificiels peuvent permettre à des biomarqueurs protéiques pour activer les enzymes qui clivent promédicaments. En variante, ces mimétiques de protéines de signalisation pourraient être en mesure d'activer contre nature des voies de signalisation cellulaire, entraînant des effets thérapeutiques.

Pour démontrer la faisabilité de cette approche, nous avons récemment créé un «capteur chimique» synthétique ⁴ qui permet le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour déclencher le clivage d'un promédicament anticancéreux en activant le glutathion-S-transférase (GST), qui est pas son partenaire de liaison naturel. La structure de ce «transducteur» se compose d'un anti-PDGF ADN aptamère qui a été modifié avec un inhibiteur de la TPS bivalent. Par conséquent, cet agent synthétique appartient à une famille de molécules ayant des sites de liaison àprotéines différentes, telles que ^5-7 inducteurs chimiques de dimérisation (CID) , ^8-10 et aussi pour le groupe de protéines de liants à base de conjugués de molécules d' oligonucléotides synthétiques. ^21/11

Les principes généraux sous-jacents à la conception de tels systèmes sont décrits ici et des protocoles détaillés pour la synthèse et le test du fonctionnement de ce «transducteur» avec des dosages enzymatiques classiques sont fournis. Ce travail est destiné à faciliter le développement de «transducteurs» supplémentaires de cette classe, qui peut être utilisé pour la médiation intracellulaire communication protéine-protéine et, par conséquent, pour induire artificiels voies de signalisation cellulaire.

La figure 1 décrit schématiquement les principes de fonctionnement des transducteurs «chimiques» synthétiques non naturels qui peuvent médier des communications protéine-protéine. Dans cette illustration, un «transducteur chimique», qui intègre des liants synthétiques pour la proteins I et II (liants I et II), permet la protéine II pour déclencher l'activité catalytique de la protéine I, qui ne fait pas son partenaire de liaison naturel. En l'absence de la protéine II, le transducteur se lie au site catalytique de l'enzyme (protéine I) et inhibe son activité (figure 1, l' état ii). La liaison du «transducteur» à la protéine II, cependant, favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II (figure 1, l' état iii), ce qui réduit son affinité envers la protéine I. En conséquence, la concentration efficace du ' transducteur libre »dans la solution est réduite, ce qui conduit à la dissociation de la protéine de transduction complexe I et à la réactivation de la protéine I (figure 1, l' état iv). Pris ensemble, ces étapes souligner trois principes fondamentaux qui sous-tendent la conception des «transducteurs» efficaces: (1) un «transducteur» devrait avoir un liant spécifique pour chacune des cibles protéiques, (2) l'betwe d'interactionen liant II et la protéine II devrait être plus forte que l'interaction entre le liant I et la protéine I, et (3) liant je dois être capable d'interagir avec la surface de la protéine II. Ce dernier principe ne requiert pas nécessairement que liant moi seul aurait une grande affinité et sélectivité pour la protéine II. Au lieu de cela, elle est basée sur nos études récentes qui montrent que l' introduction d' une molécule synthétique à proximité d'une protéine est de nature à favoriser les interactions entre cette molécule et la surface de la protéine ^19,22,23.

Figure 1:. Utilisation des principes de «transducteurs chimiques» Lorsque le «capteur chimique» est ajouté à une protéine active I (état i), il se lie à son site actif par le biais de liant I et inhibe son activité (état ii). En présence de la protéine II, cependant, la non liés "chimique transducer 'interagit avec la protéine II liant à travers II, qui favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II. Ce liant induit I-protéine interaction II réduit la concentration efficace de liant I, ce qui conduit à la dissociation de la «protéine de transducer' complexe I et de la protéine I réactivation (état iv). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Protocol

1. Synthèse de la «Chemical Transducer» Préparatifs préliminaires Préparer 2 M d'acétate de triéthylammonium (TEAA) un tampon en mélangeant 278 ml de triéthylamine avec 114 ml d'acide acétique et 400 ml d'eau ultrapure. Ajuster le pH à 7 et ajouter de l'eau à un volume final de 1 L. Gardez-le dans une bouteille sombre. Remarque: Cette solution est stable pendant des années. Préparer une solution d'acide ascorbique à 5 mM en dissolvant 18 mg d'a…

Representative Results

La conception, la synthèse et le mécanisme d'action d'un «capteur chimique» qui peut induire la communication artificielle entre PDGF et la TPS sont présentés dans la figure 2. La structure du «transducteur» intègre un aptamère PDGF ADN et un amide bis-éthacrynique (Bea ), qui est un inhibiteur connu de la GST (figure 2a). 19 Ces liants permettent le «transducteur» pour se lier à la fois le PDGF et GST avec des affinités…

Discussion

We presented a method for designing and testing of a ‘chemical transducer’ that can induce artificial communication between two naturally unrelated proteins, GST and PDGF, without modifying the native proteins. The unnatural GST-PDGF communications could be detected in real time by using enzymatic assays that follow the changes in the activity of GST in the presence of the ‘chemical transducer’ and increasing the concentrations of PDGF. In addition to detecting the activation of GST by PDGF, these assays were used to fol…

Materials

1-chloro-2,4-dinitrobenzene	Sigma-Aldrich	237329
Acetic acid	Bio Lab	01070521
Acetnitrile	J.T.Baker	9017-03
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate	Merck-Millipore	102790
Dimethyl sulfoxide	Merck-Millipore	802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological Industries	02-023-5A
Ethacrynic acid	Tokyo Chemical Industry Co. Ltd	E0526
Glutathione-s-transferase M1-1	Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K	Sigma-Aldrich	J4137
L-glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251
Magnesium Chloride	J.T.Baker	0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit	Cayman Chemical	780001
Oligonucleotides	W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University		custom order
PDGF-BB	Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA	Sigma-Aldrich	678937
Triethylamine	Sigma-Aldrich	T0886
Desalting column	GE Healthcare	illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC	Waters	2695 separation module
HPLC column	Waters	XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column	Waters	XBridgeTM OST C18 column (2.5μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader	BioTek	synergy H4 hybrid