약물 치료와<em> 생체</em>은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
조골 세포는 골 기질의 회전율을 조정 뼈 재 흡수 파골 세포 상호 작용 및 골 항상성을 제어하는 뼈 형성. 메다카 및 지브라 피쉬 유충 널리 골 형성, 변성 및 수리 동안 골 세포의 행동을 분석하는데 사용된다. 그들의 광학 선명도는 형광 표지 된 뼈 세포와 광물 골격 매트릭스에 결합 된 형광 염료의 시각화 할 수 있습니다. 우리 연구소는 열 충격 유도 성 프로모터의 제어하에 파골 세포 유도 인자 핵 인자 κB 리간드 (RANKL)의 수용체 활성제을 표현 형질 전환 메다카 물고기를 생성했습니다. 카 텝신 K (ctsk) 프로모터의 제어하에 nlGFP 식으로 기자 라인으로 시각화 할 수 있습니다 활성화 된 파골 세포의 과잉 형성 RANKL 결과 자궁외 식입니다. RANKL 유도 및 자궁외 파골 세포 형성이 심한 골다공증과 같은 표현형으로 이어집니다. 복합 형질 전환 메다카 리NES ctsk 표현은 : nlGFP 조기 골아 세포의 osterix (OSX) 프로모터의 제어 하에서 파골 세포뿐만 아니라 mCherry, 두 세포 유형의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 이것은 뼈의 퇴행 및 수리 조건 하에서 세포 행동의 생체의 관찰을 용이하게한다. 여기서, 우리는 일반적으로 인간의 골다공증 치료에 사용되는 약물을 시험하는 라이브 영상을위한 프로토콜을 기술하기 위해이 시스템의 사용을 설명한다. 메다카 모델 세포 배양 및 마우스에서 연구를 보완하고, 골격계 약물 작용의 생체 내 분석을위한 신규 한 시스템을 제공한다.
Introduction
척추 동물의 골격, 기관에 대한 구조 지원과 보호를 제공 이동성을 허용하고, 칼슘의 공급원 역할을한다. 생활 전반에 걸쳐, 세포 외 골 기질은 지속적으로 뼈의 안정성과 강성을 유지하기 위해 인계된다. 이 과정은 긴밀하게 조율 된 활동과 뼈를 형성하는 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포의 상호 작용을 필요로한다. 조골 세포는 다 능성 간엽 전구 세포로부터 유래하고, 유골 뼈 매트릭스 (10)의 일부를 형성 단백질 콜라겐이 생성된다. 조골 세포는 골의 항상성 (7)를 제어하기 위해 요구되는 세포 유형, 양자의 균형 작업을 달성하는 파골 세포와 상호 작용한다. 때문에 이러한 복잡한 상호 작용을 조절, 약물 치료 및 골 항상성에 대한 반응이 완전히 시험 관내 연구에서 사용하여 검사 할 수 없다. 따라서, 동물 모델에 대한 강한 요구가있다. 세포 배양 설정에 비해 생체 내 모델에 제공 할 수있다골 다세포 환경 내의 네트워크에 대한 통찰력.
수많은 마우스 모델 골다공증 (16)를 포함하여 인간 골 질환의 다양한 존재한다. 그러나 크기와 마우스 배아의 접근성 골격 프로세스의 실시간 이미징을위한 상당한 제한을 나타냅니다. 작은 경골 어류, 다른 한편으로는, 생체 내 영상을위한 매력적인 대안으로 작용한다. 제브라 피쉬 (다니오 레 리오)와 송사리 (오리 지 아스 쿠르 latipes)는 지난 20 년 17, 19, 22, 24을 통해 골격 연구를위한 인기있는 동물 모델이되었다. 경골 어류와 포유류의 뼈 구조와 생리적 수준에서 모두 매우 유사하며, 키 조절 유전자 및 신호 전달 경로의 대부분은 3을 보존하고 있습니다. 포유 동물에서와 같이, 경골 어류 신중 골아 세포와 골 형성 및 골 흡수의 균형 (26) 파골 세포의 활성을 조절한다. 파이의 가장 중요한 광학 선명도SH 유충은 골 세포와 살아있는 동물의 세포 과정의 관찰을 용이하게 석회화 골격 매트릭스 8, 9, 12, 21, 23, 라벨을 형광 리포터의 사용을 허용한다. 또한, 유전 적 도구 일련 물고기 생 의학적으로 중요한 연구를 촉진하기 위해 생성되었다. 특히 송사리, CrispR / Cas9 2, 6을 추적 세포 혈통 및 사이트 특정 형질 전환 (14)가 최근 설립 널리 사용 15에있다 된 표적 유전자 돌연변이 방법하십시오.
작은 유생 경골 성공적 여러 약리 관련 약물 1 (18)의 발견으로 이끄는 화학 스크린에 사용되었다.
물고기 유충 DMSO 저농도 내성이며, 피부를 통해 또는 위장관 1 ~ 5 중, 그들의 수중 환경에서 화합물을 흡수 할 수있다. 우리 연구실 이전에 담당자다양한 osteoblast- 및 파골 세포 – 특이 적 프로모터의 제어하에 뼈 세포에서 형광 기자를 표현 orted 형질 전환 메다카 라인. 20, 21, 성숙한 조골 세포 (오스테오칼신, OSC) (27), 및 파골 세포 (카 텝신 K, ctsk) 24;이 조기 조골 세포 (osterix, OSX에 콜라겐 10A1, col10a1)를 포함한다. 또한 열 쇼크 – 유도 성 프로모터 (24)의 제어 하에서 파골 세포 유도 인자 핵 인자 κB 리간드 (RANKL) 수용체 활성제를 발현하는 형질 전환 라인을 생성.
이 시스템에서 RANKL의 유도 활성 파골 세포의 이소성 형성을 초래한다. 이 추체의 대폭 감소 광물로 증가 골 흡수 및 심한 골다공증 같은 표현형에 이르게. 최근이 모델에서 파골 세포 활성은 비스포스포네이트에 티드로 네이트 및 알렌드로네이트, TW에 의해 차단 될 수 있음을 보여 주었다일반적으로 인간의 골다공증 치료에 사용되는 O 약물, 따라서 골다공증 (27)에 적합한 모델 시스템으로 송사리의 유효성을 검사.
많아서 무리 크기 급속한 발전 및 배아의 작은 크기로, 형질 전환 메다카 유충 골다공증 약물의 대규모 스크리닝과 골 세포 거동의 생체 내 분석을 위해 유일하게 적합하다. 송사리의 연구는 따라서 효율적으로 세포 배양과 인간의 뼈 질환에 대한 새로운 치료 목표와 새로운 치료법을 발견 겨냥한 쥐 실험을 보완 할 수 있습니다.
본 연구에서는 일반적인 골다공증 약물, 알렌드로네이트와 송사리 뼈 기자 유충을 치료하는 프로토콜을 설명합니다. 장착 골 기질 및 골 세포의 라이브 영상을위한 제조 방법을 처리 수 유충 또한 상세히 설명한다. 이러한 프로토콜들은 쉽게 다른 작은 화학 화합물에 적용 할 수있는 골 근육 또는 골 흡수 약물로서 어느 작품. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
다른 샘플을 비교할 때 열 충격 처리를위한 조건이 일치하고 안정한 것이 중요하다. 안정한 온도 조건은 ctsk 스크리닝에 의해 확인 될 수있다 결과적으로, 비교 파골 세포 형성을 형질 전환 유충에서 RANKL 유도 비슷한 수준을 보장하고 : nlGFP 식. 궁극적으로,이 ALC 염색에 의해 검증으로 유도 이소성 골 흡수와 골다공증 병변의 유사한 정도에 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 교육 싱가포르 교육부 (MOE, 허가 번호 2013-T2-2-126)과 건강, 미국의 국립 연구소 (NIH, 수 1R21AT008452-01A1을 부여)에서 보조금에 의해 투자되었다. TY는 생물 과학의 NUS학과 대학원 장학금을 받았다. 우리는 그들의 지속적인 지원을 위해 Bioimaging 과학에 대한 NUS 센터 (CBIS)의 공 촛점 단위 감사합니다.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
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