علاج المخدرات و<em> في فيفو</em> التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
عظم تشكيل بانيات تتفاعل مع الخلايا الآكلة-resorbing العظام لتنسيق دوران مصفوفة العظام والتحكم توازن الهيكل العظمي. وتستخدم الميداكا واليرقات الزرد على نطاق واسع لتحليل سلوك الخلايا العظمية خلال تكوين العظام، انحطاط، والإصلاح. من الوضوح البصري يسمح التصور من fluorescently المسمى خلايا العظام والأصباغ الفلورية بد أن المصفوفة الهيكلية المعدنية. وقد ولدت لدينا مختبر الأسماك الميداكا المعدلة وراثيا التي تعبر عن العامل الذي يحفز مستقبلات ناقضة العظم المنشط للعامل النووي كيلوبايت يجند (RANKL) تحت سيطرة حرارة المروج صدمة محرض. التعبير خارج الرحم النتائج RANKL في تشكيل الزائد من الخلايا الآكلة تفعيلها، والتي يمكن أن تصور في خطوط مراسل التعبير nlGFP تحت سيطرة K (ctsk) المروج كاثبسين. الحث RANKL وتشكيل ناقضة العظم خارج الرحم يؤدي إلى الظواهر الشديدة مثل هشاشة العظام. مركب المعدلة وراثيا لى الميداكاالأخبار التي تعبر عن ctsk: nlGFP في الخلايا الآكلة، وكذلك mCherry تحت سيطرة (سكس) المروج osterix في بانيات المبكرة، ويمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين كل من أنواع الخلايا. وهذا يسهل عملية المراقبة المجراة من السلوك الخلوية في ظل ظروف انحطاط العظام وإصلاح. هنا، نحن تصف استخدام هذا النظام لاختبار دواء يستخدم عادة في علاج هشاشة العظام البشرية وتصف بروتوكول للتصوير الحية. نموذج الميداكا يكمل دراسات في زراعة الخلايا والفئران، ويقدم نظام جديد للتحليل في الجسم الحي من عمل الدواء في نظام الهيكل العظمي.
Introduction
يوفر هيكل عظمي الفقاريات الدعم الهيكلي وحماية الأجهزة، ويتيح التنقل، ويخدم كمصدر للكالسيوم. في جميع مراحل الحياة، يتم تشغيل مصفوفة العظام خارج الخلية بشكل مستمر على مدى للحفاظ على الاستقرار العظام وصلابة. وهذه العملية تتطلب النشاط منسق بإحكام والتفاعل بين الخلايا بانية العظم تشكيل العظام والخلايا الآكلة-resorbing العظام. وتستمد بانيات من الأسلاف الوسيطة متعددة القدرات وإنتاج الكولاجين لتشكيل عظمية، الجزء البروتينية للمصفوفة العظام 10. بانيات تتفاعل مع الخلايا الآكلة لتحقيق النشاط متوازن لكل أنواع الخلايا، وهو مطلوب للسيطرة على العظام التوازن 7. وبسبب هذه التفاعلات التنظيمية المعقدة، والاستجابات للعلاج بالعقاقير والتوازن العظام لا يمكن فحص كامل استخدام في الدراسات المختبرية. وبالتالي، هناك طلب قوي على النماذج الحيوانية. مقارنة الإعدادات زراعة الخلايا، في النماذج الحية يمكن أن توفرمعلومات قيمة حول الشبكات متعددة الخلايا ضمن بيئة العظام.
وتوجد نماذج الماوس عديدة لمجموعة متنوعة من اضطرابات العظام البشرية بما في ذلك هشاشة العظام 16. ومع ذلك، فإن حجم وسهولة الوصول إليها من أجنة الفئران تمثل قيودا كبيرة للتصوير المباشر لعمليات والهيكل العظمي. الأسماك مكتملة العظام الصغيرة، من ناحية أخرى، بمثابة بديلا جذابا للتصوير في الجسم الحي. الزرد (دانيو rerio) والميداكا (Oryzias latipes) أصبحت نماذج حيوانية شعبية للبحث الهيكل العظمي خلال العقدين الماضيين 17 و 19 و 22 و 24. العظام في الأسماك مكتملة العظام وفي الثدييات هي مشابهة جدا، سواء على الهيكلية وعلى المستوى الفيزيولوجي، والعديد من الجينات التنظيمية الرئيسية ومسارات إشارات يتم حفظها 3. كما في الثدييات والأسماك مكتملة العظام تنظم بعناية نشاط الخلايا بانية العظم والخلايا الآكلة لتحقيق التوازن بين تكوين العظام وارتشاف 26. الأهم من ذلك، وضوح البصري فايش تسمح اليرقات استخدام للصحفيين الفلورسنت لتسمية خلايا العظام والهيكل العظمي مصفوفة متكلسة 8، 9، 12، 21، 23، مما يسهل مراقبة العمليات الخلوية في الحيوانات الحية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء سلسلة من الأدوات الوراثية لتسهيل البحوث ذات الصلة بالطب الحيوي في الأسماك. لالميداكا على وجه الخصوص، وسائل لطفرة جينية التي تستهدفها كريسبر / Cas9 2، خلية النسب تتبع 6، وtransgenesis 14 استحدثت مؤخرا وأصبحت الآن على نطاق واسع في استخدام 15 في مواقع محددة.
وقد استخدمت مكتملة العظام اليرقات الصغيرة بنجاح للشاشات الكيميائية، والتي أدت إلى اكتشاف العديد من الأدوية ذات الصلة الصيدلانية 1، 18.
يرقات الأسماك متسامحة لتركيزات منخفضة من DMSO وقادرة على استيعاب المركبات من البيئة المائية، وذلك إما عن طريق الجلد أو عن طريق الجهاز الهضمي 1، 5. مختبرنا من قبل مندوبorted خطوط الميداكا المعدلة وراثيا التي تعبر عن صحفيين الفلورسنت في خلايا العظام تحت سيطرة مختلف osteoblast- والمروجين، ناقضة العظم معين. وتشمل هذه بانيات المبكرة (الكولاجين 10a1، col10a1، osterix، OSX) 20، 21، بانيات ناضجة (أوستيوكالسين، مكتب المنسق الخاص) 27، والخلايا الآكلة (كاثبسين K، ctsk) 24. ونحن أيضا ولدت خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن عامل يحفز مستقبلات ناقضة العظم المنشط للعامل النووي كيلوبايت يجند (RANKL) تحت سيطرة الحرارة صدمة محرض المروج 24.
تحريض RANKL في هذا النظام يؤدي إلى تشكيل خارج الرحم من الخلايا الآكلة النشطة. وهذا يؤدي إلى زيادة ارتشاف العظام وهشاشة العظام تشبه النمط الظاهري شديدة، مع انخفاض شديد في تمعدن في الهيئات الفقري. وأظهرت لنا مؤخرا أن نشاط ناقضة العظم في هذا النموذج يمكن أن يكون قد تم حظره من قبل اتيدرونات البايفوسفونيت وأليندرونات، TWالمخدرات س تستخدم عادة في علاج هشاشة العظام البشرية، وبالتالي من صحة الميداكا كنظام نموذج مناسب لهشاشة العظام 27.
نظرا لحجمها الكبير الحضنة، والتطور السريع، وصغر حجم الأجنة، المعدلة وراثيا الميداكا اليرقات هي مناسبة فريدة لفحص على نطاق واسع من العقاقير هشاشة العظام وللتحليل في الجسم الحي من سلوك الخلايا العظمية. دراسات في الميداكا وبالتالي يمكن أن تكمل بكفاءة التجارب في مزارع الخلايا وفي الفئران التي تهدف إلى اكتشاف أهداف علاجية جديدة وعلاجات جديدة للاضطرابات العظام البشرية.
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول لعلاج الميداكا اليرقات العظام مراسل مع المخدرات هشاشة العظام شيوعا، أليندرونات. نحن أيضا وصف بالتفصيل كيف اليرقات المعاملة هي التي شنت والمعدة للتصوير حي لمصفوفة العظام والخلايا العظمية. هذه البروتوكولات يمكن أن تتكيف بسهولة مع مركبات كيميائية الصغيرة الأخرى التي عمل إما الابتنائية العظام أو المخدرات antiresorptive. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
ومن الضروري أن الظروف لعلاج الصدمة الحرارية هي متسقة ومستقرة عند مقارنة عينات مختلفة. درجات الحرارة مستقرة تضمن مستويات مماثلة من RANKL الاستقراء في اليرقات المعدلة وراثيا، وبالتالي تشكيل ناقضة العظم ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من المنح المقدمة من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (وزارة التربية، عدد المنح 2013 T2-2-126) والمعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية (NIH، منح عدد 1R21AT008452-01A1). تلقى تاي على منحة دراسات عليا من وزارة جامعة سنغافورة الوطنية للعلوم البيولوجية. نشكر وحدة مبائر من مركز جامعة سنغافورة الوطنية للعلوم Bioimaging (CBIS) لدعمهم المستمر.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than ‘bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
