Il trattamento di droga e<em> In Vivo</em> Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
Che formano l'osso osteoblasti interagiscono con osteoclasti osso-riassorbono per coordinare il fatturato di matrice ossea e per controllare l'omeostasi scheletrica. Medaka e larve di pesce zebra sono ampiamente utilizzati per analizzare il comportamento delle cellule ossee durante la formazione ossea, degenerazione, e la riparazione. La loro chiarezza ottica permette la visualizzazione di cellule ossee fluorescenza etichettati e coloranti fluorescenti legati alla matrice mineralizzata scheletrico. Il nostro laboratorio ha generato pesci transgenici Medaka che esprimono il fattore di osteoclasti che induce Receptor Activator of Nuclear factor-kB Ligand (RANKL) sotto il controllo di un promotore di calore shock inducibile. Espressione ectopica di risultati RANKL in eccesso formazione degli osteoclasti attivati, che possono essere visualizzati in linee giornalista con espressione nlGFP sotto il controllo del K (ctsk) promotore catepsina. induzione RANKL e la formazione degli osteoclasti ectopica porta a gravi fenotipi osteoporosi-like. Composto transgenico Medaka Lines che esprimono ctsk: nlGFP in osteoclasti, nonché mCherry sotto il controllo del Osterix (osx) promotore in osteoblasti prematuri, possono essere utilizzati per studiare l'interazione di entrambi i tipi di cellule. Questo facilita l'osservazione in vivo del comportamento cellulare in condizioni di degenerazione e riparazione ossea. Qui, descriviamo l'uso di questo sistema per testare un farmaco comunemente utilizzato nella terapia dell'osteoporosi umana e descrivere un protocollo per l'imaging in tempo reale. Il modello Medaka integra studi in colture cellulari e topi, e offre un nuovo sistema per l'analisi in vivo di azione farmaco nel sistema scheletrico.
Introduction
Lo scheletro vertebrato fornisce supporto strutturale e protezione per organi, permette la mobilità, e serve come fonte di calcio. Per tutta la vita, la matrice ossea extracellulare viene continuamente girato per mantenere la stabilità ossea e rigidità. Questo processo richiede l'attività strettamente coordinato e interazione degli osteoblasti che formano l'osso e osteoclasti osso-riassorbono. Gli osteoblasti derivano da progenitori mesenchimali multipotenti e producono collagene per formare il osteoide, la parte proteica della matrice ossea 10. Osteoblasti interagiscono con gli osteoclasti per realizzare un'attività equilibrata di entrambi i tipi di cellule, che è richiesto per controllare l'omeostasi ossea 7. A causa di queste interazioni normative complesse, risposte al trattamento farmacologico e l'omeostasi ossea non possono essere completamente esaminati utilizzando studi in vitro. Quindi, vi è una forte richiesta di modelli animali. Rispetto alle impostazioni di coltura cellulare, in modelli in vivo può fornireinformazioni preziose nelle reti pluricellulari all'interno dell'ambiente osso.
Esistono numerosi modelli di mouse per una varietà di malattie delle ossa umane, tra cui l'osteoporosi 16. Tuttavia, la dimensione e l'accessibilità di embrioni di topo rappresentano significative limitazioni per l'imaging dal vivo di processi scheletrici. Piccoli pesci teleostei, invece, servire come un'alternativa interessante per l'imaging in vivo. Zebrafish (Danio rerio) e Medaka (Oryzias latipes) sono diventati popolari modelli animali per la ricerca scheletrico nel corso degli ultimi due decenni, 17, 19, 22, 24. Bone nei pesci teleostei e nei mammiferi è molto simile, sia strutturale che a livello fisiologico, e molti dei geni regolatori chiave e vie di segnalazione sono conservati 3. Come nei mammiferi, pesci teleosteo regolare accuratamente l'attività degli osteoblasti e osteoclasti per bilanciare la formazione dell'osso ed il riassorbimento 26. Ancora più importante, la chiarezza ottica di fish larve permette l'utilizzo di reporter fluorescenti per marcare le cellule ossee e calcificate matrice scheletrico 8, 9, 12, 21, 23, che facilita l'osservazione dei processi cellulari in animale vivente. Inoltre, una serie di strumenti genetici è stato generato per facilitare la ricerca biomedico rilevante nel pesce. Per Medaka in particolare, i metodi per mirata mutazione genetica da CRISPR / Cas9 2, cellule-lineage tracing 6, e transgenesi 14 sono state di recente costituzione e sono ora ampiamente in uso 15 site-specific.
Piccole larve teleosteo sono stati utilizzati con successo per gli schermi chimici, che hanno portato alla scoperta di diversi farmaci farmacologicamente rilevanti 1, 18.
Pesce larve sono tolleranti a basse concentrazioni di DMSO e sono in grado di assorbire composti dal loro ambiente acquatico, sia attraverso la pelle o attraverso il tratto gastrointestinale 1, 5. Il nostro laboratorio in precedenza rappresentanteorted linee Medaka transgenici che esprimono i reporter fluorescenti in cellule ossee sotto il controllo di vari osteoblasti e promotori specifici osteoclasti. Questi includono osteoblasti prematuri (collagene 10A1, col10a1; Osterix, OSX) 20, 21, osteoblasti maturi (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclasti (catepsina K, ctsk) 24. Abbiamo anche generato una linea transgenica che esprime il fattore di osteoclasti che induce Receptor Activator of Nuclear factor-kB Ligand (RANKL) sotto il controllo di un shock termico-inducibile promotore 24.
Induzione di RANKL in questo sistema porta alla formazione ectopica di osteoclasti attivi. Questo porta ad un aumento riassorbimento osseo e una grave fenotipo osteoporosi simile, con drasticamente ridotta mineralizzazione nei corpi vertebrali. Abbiamo recentemente dimostrato che l'attività degli osteoclasti in questo modello può essere bloccato dalla bifosfonati etidronato e alendronato, TWO farmaci comunemente utilizzati nella terapia dell'osteoporosi umana, convalidando così Medaka come sistema modello adatto per l'osteoporosi 27.
Grazie alla loro grande prole, rapido sviluppo, e piccole dimensioni di embrioni, transgenici Medaka larve sono particolarmente adatta per lo screening su larga scala di farmaci osteoporosi e per l'analisi in vivo del comportamento delle cellule ossee. Gli studi in Medaka quindi possono integrare in modo efficiente esperimenti in colture cellulari e nei topi che hanno lo scopo di scoprire nuovi bersagli terapeutici e nuove terapie per i disturbi delle ossa umane.
Nel presente studio, si descrive un protocollo per il trattamento di Medaka larve osso-giornalista con il farmaco osteoporosi comuni, l'alendronato. Descriviamo anche in dettaglio come trattate le larve sono montati e preparati per l'imaging dal vivo di matrice ossea e cellule ossee. Questi protocolli possono essere facilmente adattate ad altri composti chimici di piccole dimensioni che sia il lavoro come anabolizzanti osso o droghe riassorbimento osseo. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
È essenziale che le condizioni per il trattamento shock termico sono coerenti e stabili quando si confrontano i diversi campioni. Condizioni di temperatura stabili garantiscono livelli simili di RANKL induzione nelle larve transgeniche e, di conseguenza, la formazione di osteoclasti comparabili, che può essere confermata da screening per ctsk: espressione nlGFP. In definitiva, questo porta ad un grado simile di riassorbimento osseo in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE, codice di autorizzazione 2013-T2-2-126) e l'Istituto Nazionale della Salute, Stati Uniti d'America (NIH, concedere numero 1R21AT008452-01A1). TY ha ricevuto una borsa di studio di laurea del Dipartimento di Scienze Biologiche NUS. Ringraziamo l'unità confocale del Centro NUS per Bioimmagini Sciences (CBIS) per il loro costante supporto.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
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