Drug Treatment en<em> In Vivo</em> Imaging van Osteoblast osteoclasten Interacties in een Medaka Fish Osteoporosis Model
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
Bone-vormende osteoblasten interageren met botresorberende osteoclasten aan de omzet van het bot matrix te coördineren en het skelet homeostase controleren. Medaka en zebravis larven worden veel gebruikt om het gedrag van botcellen tijdens botvorming, degeneratie en reparatie analyseren. De optische helderheid maakt de visualisatie van fluorescent gelabelde botcellen en fluorescerende kleurstoffen gebonden aan het skelet gemineraliseerde matrix. Ons laboratorium heeft transgene medaka vis die de osteoclasten-inducerende factor Receptor Activator van de Nucleaire-factor KB Ligand (RANKL) onder de controle van een heat shock-induceerbare promoter uit te drukken gegenereerd. Ectopische expressie van RANKL resulteert in de vorming van overmaat geactiveerde osteoclasten, die reporter lijnen kunnen worden gevisualiseerd met nlGFP expressie onder controle van de cathepsine K (ctsk) promoter. RANKL inductie en buitenbaarmoederlijke vorming van osteoclasten leidt tot ernstige osteoporose-achtige fenotypes. Samengestelde transgene medaka lines die expressie ctsk: nlGFP in osteoclasten, alsmede mCherry onder controle van de osterix (osx) promotor in premature osteoblasten, kan worden gebruikt om de interactie van beide celtypen te bestuderen. Dit vergemakkelijkt het in vivo waarneming van cellulair gedrag onder omstandigheden van botdegeneratie en reparatie. Hier beschrijven we het gebruik van dit systeem een geneesmiddel algemeen in menselijke osteoporosetherapie testen en beschrijven een protocol voor levende beeldvorming. De medaka model vormt een aanvulling op studies in celcultuur en muizen, en biedt een nieuw systeem voor de in vivo analyse van de werking van het geneesmiddel in het skelet.
Introduction
De vertebraat skelet geeft structurele steun en bescherming van organen, maakt de mobiliteit, en dient als een bron van calcium. Gedurende het hele leven, wordt de extracellulaire botmatrix continu overgedragen aan het bot stabiliteit en stijfheid te behouden. Dit proces vereist de strak gecoördineerde activiteit en samenspel van botvormende osteoblasten en botresorberende osteoclasten. Osteoblasten afgeleid van multipotente mesenchymale voorlopercellen en produceren collageen de osteoid het eiwitachtige deel van het bot matrix 10 te vormen. Osteoblasten interactie met osteoclasten een evenwichtige activiteit van beide celtypen, die nodig is om bothomeostase 7 controle. Vanwege deze complexe regulerende interacties respons op behandeling met geneesmiddelen en bothomeostase niet volledig onderzocht onder toepassing van in vitro studies. Er is dus een sterke behoefte aan diermodellen. Vergeleken met de celkweek instellingen in vivo modellen kunnenwaardevol inzicht in de meercellige netwerken binnen het bot milieu.
Talrijke muismodellen aanwezig voor diverse humane botaandoeningen waaronder osteoporose 16. De omvang en de toegankelijkheid van muizenembryo's vertegenwoordigen belangrijke beperkingen voor levende beeldvorming van het skelet processen. Kleine beenvissen, anderzijds, dienen als een aantrekkelijk alternatief voor in vivo beeldvorming. De zebravis (Danio rerio) en medaka (Oryzias latipes) zijn populair geworden diermodellen voor skeletale onderzoek in de afgelopen twee decennia 17, 19, 22, 24. Been beenvissen en zoogdieren heel gelijkaardig, zowel structureel en een fysiologisch niveau, en veel van de belangrijkste regulerende genen en signaalwegen geconserveerd 3. Zoals in zoogdieren, beenvissen zorgvuldig reguleren van de activiteit van osteoblasten en osteoclasten vorming en resorptie 26 botbalans. Belangrijker, de optische helderheid van fish larven maakt het gebruik van fluorescente reporters op botcellen en het gecalcificeerde skeletachtige matrix 8, 9, 12, 21, 23, die de waarneming van cellulaire processen in het levende dier vergemakkelijkt labelen. Daarnaast is een aantal genetische hulpmiddelen gegenereerd voor biomedisch relevant onderzoek bij vissen te vergemakkelijken. Voor medaka in het bijzonder methoden voor gerichte genmutatie door CRISPR / Cas9 2, cell-lineage tracing 6, en site-specific transgenese 14 zijn onlangs opgericht en zijn nu op grote schaal in gebruik 15.
Kleine teleost larven zijn met succes gebruikt voor chemische schermen, wat leidde tot de ontdekking van verschillende farmacologisch relevante drugs 1, 18.
Vislarven tolerant lage concentraties DMSO en kunnen verbindingen absorberen uit hun aquatische milieu, hetzij door de huid of door het maagdarmkanaal 1, 5. Ons laboratorium eerder reported medaka transgene lijnen die fluorescente reporters in botcellen tot expressie onder de controle van verschillende osteoblast- en osteoclast-specifieke promoters. Deze omvatten premature osteoblasten (collageen 10A1, col10a1; osterix, osx) 20, 21, mature osteoblasten (osteocalcine, OSC) 27, en osteoclasten (cathepsine K, ctsk) 24. We genereerden ook een transgene lijn die de osteoclast-inducerende factor Receptor Activator van nucleaire factor KB ligand (RANKL) onder de controle van een hitteschok-induceerbare promoter 24 uitdrukt.
Inductie van RANKL in dit systeem leidt tot de vorming van ectopisch actieve osteoclasten. Dit leidt tot verhoogde botresorptie en ernstige osteoporose fenotype, met drastisch verminderd mineralisatie in de wervellichamen. We hebben onlangs bleek dat de osteoclastische activiteit in dit model kan worden geblokkeerd door de bisfosfonaten etidronaat en alendronaat, two geneesmiddelen die vaak gebruikt in de menselijke osteoporosetherapie, waardoor valideren medaka een geschikt modelsysteem voor osteoporose 27.
Door hun grote kroost omvang, snelle ontwikkeling, en de geringe afmetingen van de embryo's, transgene medaka larven zijn bij uitstek geschikt voor de grootschalige screening van osteoporose drugs en voor de in vivo analyse van het bot cel gedrag. Studies in medaka dus efficiënt experimenten aanvullen in celkweken en in muizen die gericht zijn op het ontdekken van nieuwe therapeutische targets en nieuwe therapieën voor menselijke botaandoeningen.
In de huidige studie beschrijven we een protocol voor de behandeling van medaka bot-reporter larven met de gemeenschappelijke osteoporose drug, alendronaat. We hebben ook in detail beschrijven hoe behandelde larven zijn gemonteerd en voorbereid op de live-beeldvorming van botmatrix en botcellen. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere kleine chemische verbindingen die ofwel werken bot anabole of antiresorptieve middelen. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Het is essentieel dat de voorwaarden voor hitteshockbehandeling consistent en stabiel bij het vergelijken van verschillende monsters. Stabiele temperaturen garanderen soortgelijke niveaus van RANKL inductie in de transgene larven en bijgevolg vergelijkbaar osteoclastvorming, die kan worden bevestigd door te screenen op ctsk: nlGFP expressie. Uiteindelijk leidt dit tot een gelijke mate van ectopische geïnduceerde botresorptie en osteoporose-achtige lae…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door subsidies van de Singapore Ministerie van Onderwijs (MOE, licentienummer 2013-T2-2-126) en het National Institute of Health, USA (NIH, verlenen nummer 1R21AT008452-01A1). TY kreeg een afgestudeerde beurs van de NUS Department of Biological Sciences. Wij danken de confocale eenheid van de NUS Centrum voor Bio-imaging Wetenschappen (CBIS) voor hun voortdurende steun.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than ‘bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
