ותרופות טיפול<em> In vivo</em> הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
עצם יוצרי אוסטאובלסטים אינטראקציה עם osteoclasts-resorbing עצם לתאם את המחזור של מטריקס העצם לשלוט הומאוסטזיס שלד. Medaka וזחלי דג זברה נמצאים בשימוש נרחב כדי לנתח את ההתנהגות של תאי עצם במהלך היווצרות, ניוון עצם, ותיקון. הבהירות האופטית שלהם מאפשרת ההדמיה של תאי עצם צבעי ניאון שכותרתו fluorescently כבול מטריצת שלד mineralized. המעבדה שלנו יצרה דגי medaka המהונדס המבטאים את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של מקדם הלם-מושרה חום. ביטוי אקטופי של תוצאות RANKL להיווצרות העודפת של osteoclasts מופעל, אשר ניתן דמיין בקווים הכתב עם ביטוי nlGFP תחת השליטה של אמרגן cathepsin K (ctsk). אינדוקצית RANKL והיווצרות osteoclast אקטופי מובילה פנוטיפים אוסטאופורוזיס דמוי חמורים. li medaka מהונדס מתחםנס מבטאי ctsk: nlGFP ב osteoclasts, כמו גם mCherry תחת השליטה של אמרגן osterix (OSX) ב אוסטאובלסטים מוקדמת, יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה של שני סוגי התאים. זה מקל על התצפית in vivo של התנהגות הסלולר בתנאים של ניוון העצם ואת החלמתה. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת זו כדי לבדוק תרופה המשמשת בדרך כלל בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם מתאר פרוטוקול הדמיה לחיות. מודל medaka מוסיף למחקרים בתרבות תא ועכברים, ומציע מערכת חדשה לניתוח vivo של פעולת תרופה במערכת השלד.
Introduction
שלד החוליות מספק תמיכה מבנית והגנה על איברים, מאפשר ניידות, ומשמש מקור לסידן. לכל אורך חייו, מטריצת העצם התאית מופעלת מעל רף כדי לשמור על יציבות עצם ונוקש. תהליך זה דורש פעילות מתואמת בחוזקה הגומלין של אוסטאובלסטים יוצרי העצם osteoclasts-resorbing העצם. Osteoblasts נגזרות אבות mesenchymal מולטיפוטנטיים ולייצר קולגן ליצירת דמוי עצם, החלק חלבוניים של מטריקס העצם 10. Osteoblasts אינטראקציה עם osteoclasts להשיג פעילות מאוזנת של שני סוגי התאים, אשר נדרש שליטת עצם הומאוסטזיס 7. בגלל אינטראקציות רגולציה המורכבות האלו, תגובות טיפול תרופתי הומאוסטזיס עצם לא ניתן לבדוק באופן מלא באמצעות במבחנה. לפיכך, קיימת דרישה חזקה במודלים של בעלי חיים. בהשוואה להגדרות תרבית תאים, במודלים vivo יכול לספקתובנה חשובה רשתות רבות-תאי בתוך סביבת העצם.
במודלים של עכברים רבים קיימים עבור מגוון רחב של הפרעות עצמות אדם כוללים אוסטאופורוזיס 16. עם זאת, הגודל והנגישות של עוברי עכברים מייצגים מגבלות משמעותיות עבור הדמית חיה של תהליכי שלד. דגים teleost קטנים, ומצד שני, לשמש חלופה אטרקטיבית הדמיה in vivo. דג זברה (Danio rerio) ו medaka (Oryzias latipes) הפכו במודלים של בעלי חיים פופולריים למחקר שלד במהלך שני העשורים האחרונים 17, 19, 22, 24. עצם חוליות דגים ביונקים דומה מאוד, הוא על מבני ברמה פיזיולוגית, ורבי גני רגולטוריים מפתח מסלולי איתות שמורים 3. כמו יונקים, דגים teleost בזהירות להסדיר את הפעילות של אוסטאובלסטים ו osteoclasts לאזן היווצרות העצם ספיגת 26. והחשוב מכל, הבהירות האופטית של fish זחלים מאפשרים שימוש כתבי ניאון לתייג תאי עצם ומטריצת השלד המסוידת 8, 9, 12, 21, 23, המאפשרת התצפית של תהליכים תאיים בתוך החי. בנוסף, שורה של כלים גנטיים נוצרה כדי להקל על מחקר biomedically רלוונטי בדגים. לקבלת medaka בפרט, שיטות מוטצית גן ממוקדת על ידי CrispR / Cas9 2, תא שושלת התחקות 6, ואתר ספציפי transgenesis 14 הוקם לאחרונה וכעת הם נרחב בשימוש 15.
זחלי חוליות קטנים שמשו בהצלחה עבור מסכים כימי, אשר הוביל לגילוי של מספר תרופות רלוונטיות פרמקולוגית 1, 18.
הזחלים דג סובלניים לריכוזים נמוכים של DMSO והם מסוגלים לספוג תרכובות מן הסביבה המימית שלהם, או דרך העור או דרך מערכת העיכול 1, 5. נציג המעבדה שלנו בעברקווי medaka מהונדסים orted מבטאי כתבי ניאון בתאי עצם בשליטת osteoblast- השונה ומקדמים ספציפיים osteoclast. אלה כוללים אוסטאובלסטים מוקדמים (קולגן 10a1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, אוסטאובלסטים בוגר (osteocalcin, OSC) 27, ו osteoclasts (cathepsin K, ctsk) 24. כמו כן, אנו שנוצרנו קו מהונדס המבטא את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של מקדם הלם-מושרה חום 24.
אינדוקציה של RANKL במערכת זו התוצאה היא ההיווצרות אקטופי של osteoclasts הפעיל. זה מוביל ספיגת עצם מוגברת פנוטיפ אוסטאופורוזיס דמוי חמור, עם מינרליזציה באופן דרסטי בגופים בחוליות. הראינו לאחרונה כי פעילות האוסטאוקלסטים במודל זה יכול להיחסם על ידי etidronate ביספוספונטים ו alendronate, TWתרופות o נפוצות בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם, ובכך אימות medaka כמערכת מודל מתאימה אוסטאופורוזיס 27.
בשל גדליו הגוזלים הגדולים שלהם, התפתחות מהירה, וגודל קטן של עוברים, זחלי medaka מהונדסים מתאימים בצורה ייחודית להקרנה בקנה המידה הגדולה של תרופות לאוסטאופורוזיס לניתוח vivo של התנהגות תא עצם. עיוני medaka ובכך יכולים להשלים ניסויים ביעילות בתרביות תאים והן בעכברים ומיועדים לגלות מטרות טיפוליות חדשות טיפולים חדשניים להפרעות עצמות אדם.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לטיפול זחלי medaka עצם כתב עם התרופה לאוסטאופורוזיס המשותפת, alendronate. כמו כן, אנו מתארים בפירוט כיצד מטופלים הזחלים הם רכובים והוכנו הדמיה חיה של מטריקס העצם תאי עצם. ניתן פרוטוקולים אלה להתאים בקלות תרכובות כימיות קטנות אחרות כי גם לעבוד אנבוליים עצם או תרופות תרופתיות. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
זה חיוני כי התנאים לטיפול הלם חום הם עקביים ויציבים כאשר משווים מדגמים שונים. בתנאי טמפרטורה יציבים להבטיח רמות דומות של אינדוקצית RANKL ב הזחלים המהונדסים, וכתוצאה מכך, היווצרות osteoclast דומה, אשר יכול להי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי תרומות של סינגפור משרד החינוך (משרד החינוך, מספר מענק 2013-T2-2-126) והמכון הלאומי לבריאות, ארה"ב (NIH, להעניק מספר 1R21AT008452-01A1). TY קיבל מלגה לתואר שני מהמחלקה NUS של מדעי הביולוגיה. אנו מודים יחידת confocal של מרכז NUS למדעי bioimaging (CBIS) בתמיכה המתמשכת שלהם.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than ‘bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
