Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Osso formando osteoblastos interagir com osteoclastos de reabsorção óssea para coordenar o volume de negócios da matriz óssea e para controlar a homeostase esquelética. Medaka e larvas de peixe-zebra são amplamente usadas para analisar o comportamento de células de osso durante a formação óssea, a degeneração, e reparação. A sua clareza óptica permite a visualização das células ósseas marcado fluorescentemente e corantes fluorescentes ligados à matriz óssea mineralizada. O nosso laboratório tem gerado Medaka peixes transgénicos que expressam o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível de choque de calor. A expressão ectópica de RANKL resulta na formação de excesso de osteoclastos activados, que podem ser visualizados em linhas com expressão repórter nlGFP sob o controlo do promotor K (CTSK) catepsina. indução RANKL e formação de osteoclastos ectópica leva a fenótipos osteoporose-like graves. Composto li medaka transgênicones que expressam CTSK: nlGFP em osteoclastos, assim como mCherry sob o controlo do osterix (OSX) promotor em osteoblastos prematuros, pode ser utilizado para estudar a interacção de ambos os tipos de células. Isto facilita a observação in vivo do comportamento celular sob condições de degeneração óssea e de reparação. Aqui, nós descrevemos a utilização deste sistema para testar um fármaco utilizada em terapia de osteoporose humana e descrever um protocolo de imagens ao vivo. O modelo Medaka complementa os estudos em cultura de células e ratinhos, e oferece um novo sistema para a análise in vivo da acção do fármaco no sistema esquelético.
O esqueleto dos vertebrados proporciona um suporte estrutural e a protecção de órgãos, permite a mobilidade, e serve como uma fonte de cálcio. Ao longo da vida, a matriz óssea extracelular é continuamente virado para manter a estabilidade óssea e rigidez. Este processo requer a actividade fortemente coordenada e interacção de osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Os osteoblastos são derivados de células progenitoras mesenquimais multipotentes e produzir colagénio para formar o osteóide, a parte proteica da matriz óssea 10. Os osteoblastos interagir com osteoclastos para alcançar uma actividade equilibrada de ambos os tipos de células, que é necessária para controlar a homeostase óssea 7. Devido a essas interações reguladoras complexas, as respostas ao tratamento medicamentoso e homeostase óssea não pode ser plenamente examinadas usando estudos in vitro. Deste modo, existe uma forte procura de modelos animais. Em comparação com as configurações de cultura de células, em modelos in vivo pode fornecerinsights valiosos sobre as redes multicelulares dentro do ambiente de osso.
Numerosos modelos de ratinho para existir uma variedade de perturbações ósseas, incluindo osteoporose humanos 16. No entanto, o tamanho ea acessibilidade de embriões de camundongos representam limitações significativas para geração de imagens ao vivo de processos esqueléticos. Peixes teleósteos pequeno, por outro lado, servir como uma alternativa atraente para imagiologia in vivo. Peixe-zebra (Danio rerio) e medaka (Oryzias latipes) tornaram-se modelos animais populares para pesquisa esquelética durante as últimas duas décadas 17, 19, 22, 24. Osso em peixes teleósteos e em mamíferos é muito semelhante, tanto em um estrutural como a nível fisiológico, e muitos dos genes reguladores-chave e as vias de sinalização são conservados 3. Como em mamíferos, peixes teleósteos regular cuidadosamente a actividade dos osteoblastos e osteoclastos para equilibrar a formação óssea e reabsorção 26. Mais importante ainda, a clareza óptica de fiSH larvas permite o uso de repórteres fluorescentes para marcar células ósseas e a matriz calcificada esquelético 8, 9, 12, 21, 23, o que facilita a observação de processos celulares em animais vivos. Além disso, uma série de ferramentas genéticas foi gerado para facilitar a pesquisa biomedicamente relevante em peixes. Para medaka em particular, métodos para mutação do gene alvo de CRISPR / Cas9 2, rastreamento de 6 células de linhagem, e site-specific transgênese 14 foram recentemente estabelecidas e são agora amplamente em uso 15.
Larvas teleósteos pequena têm sido usadas com sucesso para as telas de químicos, o que levou à descoberta de várias drogas farmacologicamente relevantes 1, 18.
Larvas de peixes são tolerantes a baixas concentrações de DMSO e são capazes de absorver compostos de seu ambiente aquático, através da pele ou através do tracto gastrointestinal de 1, 5. Nosso laboratório anteriormente reported medaka linhas transgénicas que expressam repórteres fluorescentes em células ósseas, sob o controlo de vários osteoblast- e promotores específicos de osteoclastos. Estes incluem osteoblastos prematuros (colágeno 10A1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclastos (catepsina K, CTSK) 24. Nós também gerou uma linha transgénica que expressa o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível por choque térmico-24.
Indução de RANKL neste sistema resulta na formação ectópica de osteoclastos activos. Isto leva a um aumento da reabsorção óssea e um fenótipo semelhante a osteoporose grave, com mineralização drasticamente reduzida nos corpos vertebrais. Recentemente, mostrou que a actividade dos osteoclastos neste modelo pode ser bloqueada pelo etidronato bisfosfonatos e alendronato, TWO drogas comumente usadas no tratamento da osteoporose humana, validando assim medaka como um sistema modelo adequado para a osteoporose 27.
Devido ao seu grande tamanho de ninhada, o rápido desenvolvimento, e pequeno tamanho de embriões, larvas Medaka transgénicos são exclusivamente adequados para o rastreio em larga escala de drogas da osteoporose e para a análise in vivo de comportamento de células ósseas. Estudos em medaka, portanto, pode eficientemente complementar experiências em culturas de células e em camundongos que visam a descoberta de novos alvos terapêuticos e novas terapias para doenças ósseas humanas.
No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para tratar larvas osso repórter medaka com a droga osteoporose comum, o alendronato. Nós também descrevem em detalhes como larvas tratadas estão montados e preparados para a imagens ao vivo da matriz óssea e células ósseas. Estes protocolos podem ser facilmente adaptada a outros compostos químicos pequenos, que tanto trabalho como anabolizante do tecido ósseo ou drogas anti-reabsorção. </ P>
Passos críticos dentro do Protocolo
É essencial que as condições para o tratamento de choque térmico são consistentes e estável quando se comparam amostras diferentes. Condições de temperatura estáveis garantir níveis semelhantes de indução RANKL nas larvas transgénicos e, consequentemente, a formação de osteoclastos comparável, que pode ser confirmada por rastreio para CTSK: nlGFP expressão. Em última análise, isso leva a um grau semelhante de reabsorção óssea i…
The authors have nothing to disclose.
Este projecto foi financiado por doações do Ministério Singapore da Educação (MOE, número de concessão 2013-T2-2-126) e do Instituto Nacional de Saúde, EUA (NIH, conceda número 1R21AT008452-01A1). TY recebeu uma bolsa de pós-graduação do Departamento de Ciências Biológicas NUS. Agradecemos a unidade confocal do Centro de Ciências NUS bioimaging (CBIS) pelo seu apoio constante.
Alendronate | Sigma | A4978 | |
alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |