Medikamentöse Behandlung und<em> In Vivo</em> Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
Knochenbildenden Osteoblasten interagieren mit dem Knochen-Osteoklasten, den Umsatz der Knochenmatrix zu koordinieren und zu Skelett Homöostase Kontrolle zu bringen. Medaka und Zebrafisch-Larven sind weit verbreitet zu analysieren das Verhalten von Knochenzellen während der Knochenbildung, Degeneration und Reparatur verwendet werden. Ihre optische Klarheit ermöglicht die Visualisierung von fluoreszierend markierten Knochenzellen und Fluoreszenz auf die mineralisierte Skelett-Matrix gebunden Farbstoffe. Unser Labor hat transgene Medaka Fisch erzeugt, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotors exprimieren. Ektopische Expression von RANKL ergibt die überschüssige Bildung von aktivierten Osteoklasten, die in reporter Linien mit nlGFP Expression unter der Kontrolle des Cathepsin K (cSt) -Promotor sichtbar gemacht werden kann. RANKL Induktion und ektopische Osteoklastenbildung führt zu schweren Osteoporose-ähnlichen Phänotypen. Verbindung transgenen Medaka lines , die ausdrücken cSt: nlGFP in Osteoklasten sowie mCherry unter der Kontrolle des osterix (OSX) -Promotor in vorzeitigem Osteoblasten, verwendet werden , um die Interaktion beider Zelltypen zu untersuchen. Dies erleichtert die in vivo Beobachtung von Zellverhalten unter den Bedingungen der Knochenabbau und Reparatur. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Systems ein Medikament häufig in menschlichen Osteoporose-Therapie verwendet zu testen und ein Protokoll für Echtzeit-Bildgebung beschrieben. Das Medaka – Modell ergänzt Studien in Zellkultur und Mäuse und bietet ein neuartiges System für die in vivo Analyse der Arzneimittelwirkung im Skelettsystem.
Introduction
Die wirbel Skelett sorgt für eine strukturelle Unterstützung und Schutz von Organen ermöglicht Mobilität und dient als Quelle für Calcium. Im Laufe des Lebens wird die extrazelluläre Knochenmatrix kontinuierlich gedreht über die Knochenstabilität und Steifigkeit zu erhalten. Dieser Prozess erfordert die eng koordinierte Aktivität und das Zusammenspiel von Knochen bildenden Osteoblasten und Knochen-Osteoklasten. Osteoblasten sind von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen abgeleitet und produzieren Kollagen die osteoid zu bilden, die proteinartiges Teil der Knochenmatrix 10. Osteoblasten mit Osteoklasten zusammenwirken , eine ausgewogene Aktivität beider Zelltypen zu erreichen, die Knochenhomöostase 7 zu steuern , erforderlich ist. Aufgrund dieser komplizierten regulatorischen Wechselwirkungen, Antworten auf eine medikamentöse Therapie und Knochenhomöostase nicht voll werden kann unter Verwendung von in vitro – Studien untersucht. Daher gibt es eine starke Nachfrage nach Tiermodellen. Im Vergleich zu den Zellkultur – Einstellungen können in – vivo – Modellen liefernwertvolle Einblicke in die vielzelligen Netzwerke innerhalb des Knochenumgebung.
Zahlreiche Mausmodelle existieren für eine Vielzahl von menschlichen Knochenerkrankungen einschließlich Osteoporose 16. Allerdings stellen die Größe und die Zugänglichkeit von Maus-Embryonen erhebliche Einschränkungen für die Live-Darstellung von Skelett Prozesse. Kleinknochenfischen, andererseits dienen als attraktive Alternative für die in vivo Bildgebung. Zebrabärbling (Danio rerio) und Medaka (Oryzias latipes) haben für Skelett-Forschung in den letzten zwei Jahrzehnten beliebte Tiermodelle werden 17, 19, 22, 24. Knochen in Knochenfischen und in Säugetieren ist sehr ähnlich, sowohl auf struktureller und auf physiologischer Ebene und viele der wichtigsten regulatorischen Gene und Signalwege sind 3 konserviert. Wie bei Säugetieren, Knochenfische regulieren sorgfältig die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten 26 Knochenbildung und Resorption zu balancieren. Am wichtigsten ist, die optische Klarheit der fish Larven ermöglicht die Verwendung von Fluoreszenz – Reportern , Knochenzellen und die verkalkten Skelettmatrix 8, 9, 12, 21, 23, die die Beobachtung von zellulären Prozessen in lebenden Tier erleichtert zu etikettieren. Darüber hinaus hat eine Reihe von genetischen Werkzeugen erzeugt worden biomedizinisch relevante Forschung in den Fischen zu erleichtern. Für Medaka insbesondere Verfahren zur gezielten Genveränderung von CRISPR / Cas9 2, Zell-Linie Tracing 6 und ortsspezifische Transgene 14 haben nun weit verbreitet in Gebrauch 15 vor kurzem gegründet und sind sind.
Kleine Teleost Larven wurden für chemische Bildschirme, die zur Entdeckung von mehreren pharmakologisch relevanten Wirkstoffe 1, 18 eingesetzt.
Fischlarven sind tolerant gegenüber niedrigen Konzentrationen von DMSO und können Verbindungen aus ihren Gewässern zu absorbieren, entweder durch die Haut oder durch den Gastrointestinaltrakt 1, 5. Unser Labor zuvor reported transgenen Medaka Linien, die fluoreszierende Reporter in Knochenzellen unter der Kontrolle von verschiedenen Osteoblasten und Osteoklasten spezifischen Promotoren exprimieren. Dazu gehören vorzeitige Osteoblasten (Kollagen 10a1, Col10a1; osterix, osx) 20, 21, reifen Osteoblasten (Osteocalcin, osc) 27, und Osteoklasten (Cathepsin K, cSt) 24. Wir erzielten auch eine transgene Linie, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator von 24 Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotor exprimiert.
Induktion von RANKL in diesem System ergibt die ektopische Bildung von aktiven Osteoklasten. Dies führt zu erhöhten Knochenresorption und eine schwere Osteoporose-ähnlichen Phänotyp, mit drastisch reduziert Mineralisierung in den Wirbelkörpern. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Aktivität der Osteoklasten in diesem Modell kann durch die Bisphosphonate Etidronat und Alendronat blockiert werden, two Medikamente häufig in menschlichen Osteoporose – Therapie, so Medaka als ein geeignetes Modellsystem für Osteoporose 27 zu validieren.
Aufgrund ihrer großen Brutgröße, schnelle Entwicklung, und die geringe Größe von Embryonen, sind transgene Medaka Larven in einzigartiger Weise geeignet für die groß angelegte Screening von Osteoporose Medikamente und für die in – vivo – Analyse von Knochenzellverhalten. so können Studien in Medaka effizient Experimente in Zellkulturen und bei Mäusen zu ergänzen, die auf die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und neuartige Therapien für menschliche Knochenerkrankungen abzielen.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll Medaka Knochen-Reporter Larven mit dem gemeinsamen Osteoporose-Medikament, Alendronat zu behandeln. Wir beschreiben auch im Detail, wie behandelten Larven montiert sind und für die Live-Darstellung von Knochenmatrix und Knochenzellen hergestellt. Diese Protokolle können leicht auf andere kleine chemische Verbindungen, die entweder Arbeit als Knochen anabole oder antiresorptiv Medikamente angepasst werden. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Es ist wichtig, dass die Bedingungen für die Hitzeschockbehandlung sind konsistent und stabil, wenn verschiedene Proben zu vergleichen. Stabile Temperaturbedingungen garantieren ähnliche Niveaus von RANKL – Induktion in transgenen Larven und damit vergleichbar Osteoklastenbildung, die durch Screenen auf cSt bestätigt werden kann: nlGFP Ausdruck. Letztendlich führt dies zu einem ähnlichen Grad an induzierter ectopic Knochenresorption und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem Singapur Bildungsministerium (MOE, Grant-Nummer 2013-T2-2-126) und das National Institute of Health, USA finanziert (NIH gewähren Nummer 1R21AT008452-01A1). TY erhielt ein Diplom-Stipendium der NUS Department of Biological Sciences. Wir danken der konfokalen Einheit der NUS Zentrum für Bioimaging Sciences (CBIS) für ihre ständige Unterstützung.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
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